四种高致病性病毒候选诊断抗原的制备及鉴定

发布时间：2017-04-20 01:01

  本文关键词：四种高致病性病毒候选诊断抗原的制备及鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:蜱传脑炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus,TBEV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)与埃博拉(Ebola Virus)病毒均是高致病性烈性病毒,对于这些病毒的实验研究需要在高等级的生物安全实验室中进行,增加了实验的成本和难度。为了能够降低实验感染风险,能在低等级生物安全实验室完成相关病毒的检测与鉴定,本实验根据4种高致病性病毒的分子结构特点,分别选取了适合用作诊断抗原的基因,用不同的表达系统表达抗原,为这4种高致病性烈性病毒的血清学特异性诊断提供了候选抗原。方法:1.将TBEV的pr M-E基因连接到p NLF1-sec N质粒中构建真核表达载体p NLF-pr M-E,并将重组质粒转染到COS7细胞中,与Nano Glo Luciferase荧光素酶蛋白进行融合表达,并通过测定细胞上清液的荧光素酶值鉴定蛋白的表达情况;间接免疫荧光试验鉴定重组蛋白与TBEV特异性抗体的结合情况;荧光素酶免疫共沉淀(Luciferase Immunoprecipitation System,LIPS)方法对20份TBEV病人阳性血清及3份正常人血清进行检测。2.通过原核表达的方法将CHIKV的E1、E2基因,YFV的E基因和Ebola V的NP基因重组表达,并通过镍柱亲和纯化重组蛋白;将CHIKV的重组蛋白作为检测抗原,通过ELISA方法对基孔恢复期病人感染血清中的特异性抗体进行检测;以YFV的重组蛋白作为检测抗原对实验室已制备的YFV免疫鼠血清中的特异性抗体进行检测;将Ebola V的重组蛋白NP作为免疫原免疫小鼠,并以NP蛋白作为检测抗原对免疫小鼠血清中的特异性抗体进行检测。结果:1.转染重组质粒p NLF-pr M-E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达;间接免疫荧光试验检测到用p NLF-pr M-E重组质粒转染的细胞与TBEV抗体特异结合;LIPS方法以重组蛋白pr M-E为检测抗原从20份TBEV患者血清中检测出19份阳性结果,3份正常人血清均为阴性。2.成功表达并纯化出CHIKV的CHIKV E1-1、CHIKVE2-1与CHIKV E2-2重组蛋白,YFV的YFV E1-1、YFV E1-2与YFV E2-1重组蛋白,以及Ebalo V的NP重组蛋白;未能成功表达CHIKV E1-2与YFV E2-2重组蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1与CHIKV E2-2三种重组抗原作均能与基孔恢复期病人感染血清特异性结合,并与同属病毒免疫的对照血清无交叉反应;YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-1三种重组抗原均能与YF免疫鼠血清中的抗体良好结合,虽与DEN3型患者血清有一定的交叉反应,但与阳性鼠血清相比可以辨别区分;成功制备了Ebola V免疫小鼠血清,血清中的抗体能与重组抗原NP特异结合,并与其它对照血清无交叉反应。结论:1.成功构建了真核表达载体p NLF-pr M-E,并在COS7细胞中进行了表达pr M-E蛋白具有良好的抗原性,可作为TBEV感染的检测抗原。2成功构建了CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YF E2-2与NP的重组表达质粒,均能在原核细胞中正确诱导表达蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-2与NP重组抗原均有良好的抗原性,有望作为CHIKV、YFV和Ebola V检测的候选诊断抗原。
【关键词】：烈性病毒 抗原 诊断 真核表达 原核表达
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.6
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-17
• 1 病毒简介10-12
• 2 病毒感染的诊断方法12-14
• 3 抗原表达系统的类型14-16
• 5 研究内容与意义16-17
• 第一部分 蜱传脑炎病毒Pr M-E抗原在真核系统中的表达及鉴定17-33
• 引言17-18
• 1 材料18-20
• 1.1 病毒及血清18
• 1.2 试剂与耗材18-19
• 1.3 常规溶液配制19-20
• 1.4 主要仪器20
• 2 方法20-28
• 2.1 重组质粒的构建20-26
• 2.2 真核蛋白的表达26-27
• 2.3 真核蛋白的鉴定27-28
• 3 实验结果28-31
• 4 讨论31-32
• 5 结论32-33
• 第二部分 三种高致病性病毒重组抗原的原核表达及鉴定33-62
• 1 引言33-35
• 2 材料35-38
• 2.1 病毒及血清35
• 2.2 试剂与耗材35-36
• 2.3 常规溶液配制36-38
• 2.4 主要仪器38
• 3 方法38-50
• 3.1 原核表达重组质粒的构建38-47
• 3.2 构建原核表达菌株47
• 3.3 重组蛋白的表达47-48
• 3.4 融合蛋白的纯化48
• 3.5 埃博拉病毒抗 NP 蛋白鼠血清的制备48-49
• 3.6 间接免疫荧光实验49
• 3.7 ELISA抗原结合特异性实验49-50
• 4 实验结果50-58
• 5 实验讨论58-61
• 6 结论61-62
• 综述62-66
• 参考文献66-73
• 个人简历73-74
• 致谢74

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1 王均珠　实习生 常青;查出烈性病毒 只需一天[N];贵阳日报;2007年

2 记者　 陈勇 通讯员　 蒋明 楚静 实习生 王珏;杨占秋扼住烈性病毒咽喉[N];湖北日报;2006年

3 陈健雄;警惕猪亚健康综合征[N];河北科技报;2007年

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1 冉鑫;四种高致病性病毒候选诊断抗原的制备及鉴定[D];安徽医科大学;2016年

  本文关键词：四种高致病性病毒候选诊断抗原的制备及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：317524