田鼠巴贝虫FTA-LAMP及基于BmSA1和SRA5抗原的诊断技术建立

发布时间：2017-08-19 20:11

  本文关键词：田鼠巴贝虫FTA-LAMP及基于BmSA1和SRA5抗原的诊断技术建立

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【摘要】：检测技术是近年来巴贝虫病防控、科研领域研究的热点、重点,也是难点。这表现在病原形态检测方法的容易漏检、敏感性差,形态鉴定仍需受过专门培训的、业务熟练的专业技术人员才能完成,特别是虫密度处于极低的状态下,更易出现漏检、假阴性。而免疫检测技术多处于实验研究阶段,已市场化的唯一免疫诊断技术是IFAT,由于判定结果需要荧光显微镜等,很难在现场和实际工作中使用。分子检测技术也基本处于实验阶段,多用于研究。而田鼠巴贝虫感染的免疫、分子检测、诊断方法,在我国更是处于实验初期起步阶段,仍致力于诊断抗原的筛选、快速免疫及分了诊断技术研究。本课题应用现代免疫学和分了生物学技术方法,通过诊断抗原筛选、克隆表达,及单、多抗制备,优化检测系统,以建立田鼠巴贝虫感染的早期快速诊断技术方法。目的本文将通过分子生物学和免疫学及其技术方法研究,建立田鼠巴贝虫感染的早期快速诊断技术方法。方法1)克隆表达田鼠巴贝虫感染鼠血清反应蛋白(SRA5),以纯化的SRA5为诊断抗原建立检测巴贝虫循环抗体的ELISA方法和胶体金试纸条法,并评价其诊断效果。2)复苏抗BmSAl单克隆抗体细胞株,大规模制备单抗,又纯化的田鼠巴贝虫BmSAl蛋自免疫新西兰兔制备抗BmSAl多抗。筛选配对建立以单克隆抗体捕捉BmSAl抗原的双抗体夹心ELISA方法和胶体金试纸条法,然后进行诊断效果评价。3)根据GenBank公布的田鼠巴贝虫基因序列,就细胞色素B基因保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP RealTime TurbidimeterLA-320仪筛选最佳引物、反应条件,建立LAMP检测方法,从保存有血液样本的FTA卡片中提取田鼠巴贝虫DNA进行LAMP,观察检测效果。结果1)经生物信息学分析了解了田鼠巴贝虫感染血清反应相关蛋白5(SRA5)的分子结构,构建了pET28a-SRA5表达载体,成功表达后获得了纯化的SRA5蛋白。以SRA5蛋白为诊断抗原,建立了SRA5-ELISA法,观察其检测田鼠巴贝虫感染鼠血清抗体的效果显示,于感染后的第4天阳性检出率即达70%,之后其抗体监出率均为100%,与疟疾、弓形虫病人血清无交叉反应。2)以SRA5抗原制备了检测循环抗体的胶体金免疫层析试纸条,用于检测田鼠巴贝虫感染鼠血清抗体。结果显示,自第4天起感染田鼠巴贝虫的小鼠血清即可检出阳性,在感染早期染虫率高于10%时即可以检测到抗体,其与疟疾、弓形虫病人血清无交叉反应,特异性100%,具早期诊断价值。以5000份长征医院PCR法筛选出来疑似巴贝虫病人30份,胶体金试纸条法诊断出来阳性率83.3%。3)以抗BmSA1的2B12单抗,成功建立了检测田鼠巴贝虫循环抗原的双抗体夹心ELISA方法,检测重组BmSA1、田鼠巴贝虫可溶性虫体抗原,检测灵敏度达0.1μg/ml。但检测感染鼠血清效果差,似不宜用于田鼠巴贝虫感染鼠血清循环抗原的检测。4)以抗BmSA1单抗2B12研制成检测特异性抗原的胶体金免疫层析试纸条法(IGCA),检测田鼠巴贝虫感染鼠血结果显示,于感染4-9天可以检测出来阳性结果即染虫率高于10%时。但在此之前和之后可能由于其虫密度较低而未能检出。5)以重组BmSA1抗原作为抗体捕获物制备了检测田鼠巴贝虫循环抗体的胶体金免疫层析试纸条。检测田鼠巴贝虫感染鼠血清及其它寄生虫病人血清结果显示,敏感性100%、特异性100%,与疟疾、弓形虫病病人血清无交叉反应,且于感染后的第7天所有感染鼠均为阳性,而部分小鼠于感染后第4天起血清检测即出现阳性结果,具有早期诊断价值。6)建立了检测田鼠巴贝虫特异性细胞色素基因的FTA-环介导等温扩增方法。检测感染鼠及其它寄生虫病结果显示,其检测限量为0.687fg/μL、特异性100%,与疟原虫、弓形虫等无交叉反应；对感染1天的田鼠巴贝虫小鼠血也可呈现阳性结果。表明,FTA-LAMP方法检测田鼠巴贝虫感染具有较好的敏感性和特异性,且具早期诊断价值。结论 首次克隆表达了田鼠巴贝虫SRA5蛋白,制备了BmSA1单克隆抗体：成功建立了检测田鼠巴贝虫感染的FTA-LAMP方法：初步建立了基于BmSA1和SRA5抗原的检测田鼠巴贝虫循环抗原和/或循环抗体的夹心-ELISA法和免疫胶体金层析试纸条。FTA-LAMP法与SRA5-IGCA、BmSA1-1GCA其具有较好的敏感性和特异性,并具一定的早期诊断价值,具有较好的发展前景,但其诊断检测效果有待进一步实验和现场验证,而检测循环抗原的双抗体夹心-ELISA和IGCA法检测效果不够理想。
【关键词】：田鼠巴贝虫 环介导等温扩增技术 BmSA1 SRA5 单克隆抗体 多抗 ELISA 胶体金试纸条
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.6;R53
【目录】：

• 中英文全称及缩写对照5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-17
• 技术路线17-18
• 第一部分 田鼠巴贝虫感染鼠血清反应蛋白SRA5的重组表达及诊断效果评价18-29
• 引言18
• 1 材料与方法18-23
• 2 结果23-28
• 3 讨论28-29
• 第二部分 BmSA1单克隆抗体捕捉抗原的ELISA方法的建立29-48
• 引言29
• 1 材料和方法29-40
• 2 结果40-47
• 3 讨论47-48
• 第三部分 检测田鼠巴贝虫感染的胶体金免疫层析试纸条的研制48-55
• 引言48
• 1 材料与方法48-50
• 2 结果50-53
• 3 讨论53-55
• 第四部分 田鼠巴贝虫感染FTA-环介导等温扩增检测技术的建立55-70
• 引言55
• 1 材料与方法55-61
• 2 结果61-68
• 3 讨论68-70
• 全文总结70-71
• 参考文献71-76
• 致谢76-77
• 综述 己贝虫感染的免疫77-85
• 参考文献82-85
• 附录185-86
• 附件86-97

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本文编号：702714