基于石墨烯荧光淬灭作用的DNA甲基化及生物小分子分析方法的研究

发布时间：2017-08-19 20:15

  本文关键词：基于石墨烯荧光淬灭作用的DNA甲基化及生物小分子分析方法的研究

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【摘要】：随着医疗技术的提高,癌症等恶性疾病的死亡率逐渐降低,癌症等不再是不治之症。而实现各种疾病的早期诊断和治疗则是提高疾病患者生存率的关键。通过对基因与癌症等基因相关的疾病的了解,从分子水平分析实现对各类疾病的早期诊断与治疗具有重要的意义。荧光分析法是一种常用的分析检测方法,具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点。而各类荧光材料(如石墨烯和石墨烯量子点)的发展使荧光传感器检测手段、检测效果、应用领域得到了显著的提高和拓展。本文旨在基于石墨烯类材料特殊的荧光性能实现疾病DNA和生物小分子的荧光分析,为某些疾病的早期诊断和治疗观察提供快速、灵敏、精确的方法。本论文主要以DNA甲基化、去甲基化引起的恶性疾病基因和高铁血红素为研究对象,实现DNA甲基转移酶、去甲基化的分析以及高铁血红素的荧光分析方法。主要内容如下：1、我们建立了一种基于氧化石墨烯荧光淬灭作用的DNA甲基转移酶活性的分析方法。该方法中使用了一种包括与GO作用的结合区域和与目标DNA杂交的感应区域的特殊单链DNA探针。单链探针吸附于GO表面,与目标DNA杂交经限制性内切酶HpaⅡ剪切后,FAM离开GO表面进入溶液,荧光信号恢复。然而,双链被M.SssⅠ甲基化后HpaⅡ无法剪切,荧光信号无明显恢复且荧光信号恢复程度与M.SssⅠ浓度有关。实验结果表明,FAM的荧光强度变化值与M.SssⅠ浓度对数值在0.1 U/mL到100 U/mL范围内具有良好的线性关系,信噪比为3时最低检测限为(0.03±0.01)U/mL。并且,该方法能灵敏地识别其它甲基转移酶,具有良好的选择性。该方法可避免由于非特异性吸附干扰物而产生虚假信号,且能有效用于MTase抑制剂的评估和筛选,有望用于抗癌药物的发现。2、我们发展了一种基于MBD2去甲基酶和限制性内切酶HpaⅡ相互作用体系来检测特定CpG位点的DNA去甲基化,并且建立一种基于氧化石墨烯荧光淬灭作用分析MBD2的方法。实验结果表明：MBD2检测范围可达到0.2-300ng/mL,最低检测限是(0.05 ±0.01) ng/mL (S/N=3).该方法对MBD2活性分析具有良好的灵敏性和选择性,并可用于复杂体系对DNA去甲基酶的检测,有望成为检测DNA去甲基水平的重要传感方法,对生物医学研究和早期临床诊断等具有重要的参考价值。3、我们通过电化学方法合成硼掺杂石墨烯量子点(BGQDs),并成功将其应用于高铁血红素(Hematin)的检测。根据高铁血红素对BGQDs的高效荧光淬灭能力,可直接分析人类红细胞中高铁血红素含量。其创新性在于本方法不仅可以实现高铁血红素的高灵敏、高选择性分析,而且本方法可直接分析红细胞中高铁血红素含量,避免了其它方法必须先分离血红蛋白等操作。在0.01-0.92 μmol/L范围内,高铁血红素浓度和荧光强度具有良好的线性关系,其最低检测限为(0.005±0.001)μmol/L(S/N=3)。此外,本方法可用于健康型和镰刀型红细胞中高铁血红素含量的分析。结果表明,健康型和镰刀型红细胞中高铁血红素浓度分别是(23.1±4.9)μmol/L和(52.5±9.5)μmol/L。我们还结合电化学方法和DFT模拟计算研究了高铁血红素对BGQDs的荧光淬灭机理,从理论上阐明了本方法的可行性。该方法可实现红细胞中高铁血红素直接、快速、灵敏、选择性的分析,且无需标记、操作简单、成本低廉,对临床检查和疾病诊断等具有潜在的应用价值。
【关键词】：荧光检测 石墨烯 BGQDs DNA甲基化和去甲基化 血红素
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.1;O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 绪论9-25
• 1.1 引言9-10
• 1.2 石墨烯10-18
• 1.2.1 石墨烯概述10-11
• 1.2.2 石墨烯的制备11-14
• 1.2.3 石墨烯功能化14-15
• 1.2.4 石墨烯在生物领域的应用15-18
• 1.3 石墨烯量子点18-24
• 1.3.1 石墨烯量子点概述18
• 1.3.2 石墨烯量子点的制备18-22
• 1.3.3 石墨烯量子点的应用22-24
• 1.4 指导思想24-25
• 第二章 基于GO荧光淬灭作用的甲基转移酶活性的分析及抑制剂的筛选25-37
• 2.1 引言25-27
• 2.2 实验部分27-29
• 2.2.1 试剂27
• 2.2.2 GO的制备27-28
• 2.2.3 MTase活性分析28-29
• 2.2.4 M.SssI选择性分析29
• 2.2.5 抑癌药物的筛选29
• 2.3 结果与讨论29-35
• 2.3.1 GO荧光淬灭能力分析29-30
• 2.3.2 M.SssI活性分析30-34
• 2.3.3 选择性研究34
• 2.3.4 抑癌药物的筛选34-35
• 2.4 结论35-37
• 第三章 GO荧光淬灭能力结合限制性内切酶分析DNA去甲基酶活性37-45
• 3.1 引言37-38
• 3.2 实验部分38-40
• 3.2.1 试剂38
• 3.2.2 GO的制备38
• 3.2.3 DNA去甲基酶活性分析38-39
• 3.2.4 MBD2选择性分析39
• 3.2.5 细胞培养和提取物的制备39-40
• 3.3 结果与讨论40-44
• 3.3.1 GO荧光淬灭能力分析40
• 3.3.2 去甲基化条件优化40-42
• 3.3.3 MBD2活性分析42-43
• 3.3.4 选择性分析43-44
• 3.4 结论44-45
• 第四章 BGQDs的制备及在分析红细胞中高铁血红素的应用45-58
• 4.1 引言45-46
• 4.2 实验部分46-49
• 4.2.1 BGQDs的制备46-47
• 4.2.2 仪器47
• 4.2.3 电化学检测47
• 4.2.4 荧光检测47-48
• 4.2.5 红细胞溶出物的制备48
• 4.2.6 理论计算48-49
• 4.3 结果与讨论49-57
• 4.3.1 BGQDs的表征及性质研究49-53
• 4.3.2 BGQDs检测高铁血红素53-54
• 4.3.3 选择性分析54
• 4.3.4 高铁血红素对BGQDs荧光响应机理研究54-56
• 4.3.5 实际检测56-57
• 4.4 结论57-58
• 第五章 结论和展望58-60
• 5.1 结论58-59
• 5.2 展望59-60
• 参考文献60-71
• 研究生期间的研究成果71-72
• 致谢72

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