噬菌体及四种生物合成纳米颗粒对两种主要水稻细菌性病原物的抗菌功能及其机制研究

发布时间：2020-04-16 09:17

【摘要】：水稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xoo)和水稻噬酸菌(Ao)分别可以引起水稻白叶枯病(BLB)和细菌性褐条病(BBS)。在对这两个水稻病害的防治过程中,大量化学药剂的使用导致了Xoo和Ao菌株产生耐药性,使得传统的化学药剂或抗生素在保护作物或控制病害爆发等方面越来越难以发挥应有的效果。此外,由于使用化学药剂易污染环境,因此开发安全环保的方法来防治植物细菌病害显得尤为关键,生物防治已被证明是防治水稻病害较为有效、持久和生态友好的方法。我们从广东、浙江和辽宁等地水稻发病样品中分离到5株Xoo噬菌体(X1、X2、X3、X4和X5),依据其二十面体的头、颈、尾、底板和尾纤维将其鉴定到有尾噬菌体(Candoviridae)中的肌尾噬菌体科(Myoviridae)。基因组DNA分析发现5株噬菌体为双链DNA核酸类型,基于DNAP基因的系统发育分析,发现它们与噬菌体OP2亲缘关系较近。噬菌体X3的潜伏期最长,为40 min,最小释放量为50 PFU/cell;寄主范围最广,能够裂解23株Xoo菌株中的22株;可显著降低Xoo菌株GZ 0011的胞外多糖产生和生物膜的形成,分别下降了 53%和43%。当在Xoo接种前喷洒噬菌体X3时,水稻白叶枯病害严重程度显著降低了83.19%,噬菌体X3进行种子处理也非常有效,水稻白叶枯病的病害严重程度能降低95.4%。由此可见,分离得到的噬菌体能够作为防治水稻白叶枯病的有效生物制剂。我们采用根围细菌Paenibacillus polymyxa Sx3、Xoo噬菌体X3裂解液、甘菊花提取物(Matricaria chamomilla L.)、橄榄叶提取物(Olea europaea)、红番茄果实提取物(Lycopersicon esculentum M.)、芙蓉花提取物(HHibiscus rosa-sinensis)为原料,生物合成了ZnO、MgO、CuO和Mn02等纳米材料,利用紫外可见光谱、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、x射线衍射(XRD)、透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对合成的纳米材料进行了能谱分析(EDS),检测了合成的纳米材料对Xoo和Ao的抗菌效果(细菌生长、生物膜形成和游动性)。由P.polymyxa菌株Sx3合成的ZnO、MgO和MnO2纳米材料的吸光度峰值分别为385、215和230nm,ZnO、MnO2和MgO的主要晶体尺寸分别为62.8、18.8和 10.9nm;ZnO的结构为立方体,MgO呈花状(纳米级),MnO2呈球形。合成的ZnO、Mn02和MgO在16.0 μg/ml的浓度时分别使Xoo菌株GZ 0003生物膜的形成降低了 74.5,74.4和80.2%,抑菌圈达到1.7,1.3和1.3 cm。在三种植物提取物合成的ZnO纳米材料中,我们发现16.0μg/ml的橄榄叶合成的纳米材料对Xoo的抗菌活性最高,抑菌圈为2.2cm,细菌增长减少67.5%,生物膜形成下降48.5%,游动性减少83.3%,良好的抑菌效果可能主要归功于其微晶尺寸为48.2nm。经MgO和MnO2处理后,Ao菌株RS-2生长分别下降62.9和71.3%,抑菌直径分别为1.8 cm和2.3 cm。MgO和MnO2纳米材料处理Ao菌株RS-2的细胞死亡率分别从0.97%提高到99.52和99.94%。ZnO、MgO和MnO2纳米材料在200.0 μg/ml时显著抑制Xoo菌株GZ 0003的生长,分别减少79.65,77.78和7].47%;生物膜形成分别减少79.17、75.77和76.72%。纳米锌、纳米镁、纳米锰、纳米铜等纳米材料的实验表明,纳米材料对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性褐条病菌的细菌生长、生物膜形成和游动性均有明显的抑制作用,且均与浓度相关。通过对平板米材料具有强烈的抗菌活性,推测其抑菌机理为细胞膜损伤导致细胞内容物丢失和活性氧的产生。通过对平板上细菌的拮抗,我们发现本研究的纳米材料具有强烈的抗菌活性,推测其抑菌机理为细胞膜损伤导致细胞内容物丢失和活性氧的产生。我们发现用200.0 μg/ml CuO、MgO和MnO2纳米材料处理的水稻,在感染Xoo时与未处理相比能显著增加植物的生长,Xoo感染的对照组水稻发病率为75.20%,CuO纳米材料对水稻白叶枯病的病害抑制率为24.12%,MgO纳米材料对水稻白叶枯病的病害抑制率为15.04%,Mn02纳米材料对水稻白叶枯病的病害抑制率为75.79%。利用CuO、MgO和MnO2纳米材料处理拟南芥植株,其光合器(Fv/Fm)的最高效率在0.80-0.85之间,说明纳米材料对植株的生理状态没有受到胁迫的影响;CuO、MgO和MnO2纳米材料处理的拟南芥相对于未处理的对照在光下PSⅡ的有效量子效率(ΦPSⅡ)显著增加;利用CuO、MgO和MnO2纳米材料处理拟南芥植株,叶绿素合成和光系统结构基因显著增加。综上所述,本研究从我国三个省份水稻病株中分离得到23株Xoo菌株和5株噬菌体,通过离体和植物实验发现,噬菌体能有效防治水稻白叶枯病;我们生物合成了纳米材料,能够有效地防治水稻白叶枯和水稻细菌性褐条病,并且对植物无毒害作用,可以作为纳米肥料和纳米药剂使用。因此,本研究为水稻白叶枯病和水稻细菌性褐条病的生物防治提供了新的且有效的方法。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.4
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本文编号：2629624