交链格孢引起的紫花苜蓿斑点病抗病品种筛选与抗病机理研究

发布时间：2020-04-16 10:23

【摘要】：近年来苜蓿斑点病发生严重,经取样鉴定该病害由病原真菌引起。为了研究不同品种间抗病感病差异,本论文以21个品种的紫花苜蓿为试验材料,综合田间试验、实验室离体叶片试验和苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性综合分析,作出抗性评价。在此基础上,为了进一步探究抗病机制,利用紫外分光光度计和荧光定量PCR仪对紫花苜蓿不同抗性品种响应病原菌不同时间阶段相关酶活性及基因表达的影响初步分析,为之后深入抗病机理研究奠定基础。结果如下:1、分别利用引物ITS1/ITS4和OPA2-1R/OPA2-1F扩增出真菌核糖体ITS片段(547bp)和OPA2-1片段(599bp),经过Genbank 比对结果均为交链格孢(Alternaria alternata)。2、通过模糊隶属函数法综合大田侵染实验的病情指数、离体叶片实验的病情指数和PAL相对酶活性指标进行评价,对21个紫花苜蓿品种进行抗病性强弱的排序分别为英斯特MT4015北林201Tango威神皇冠巨能9953010斯贝德Dryland4020巨能2巨能801巨能601巨能7-耐望维多利亚巨能7肇东耐盐之星准葛尔新疆大叶。3、以新疆大叶、北林201、皇冠、耐盐之星为实验材料研究0-18d抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性变化规律。试验结果表明,接菌后O-6d是苜蓿APX、CAT、POD抗氧化酶响应交链格孢菌的关键时间:CAT、APX酶活性降低,可使H2O2短时间内积聚,放大逆境胁迫的信号分子;POD酶活性升高,将清除过高浓度的H2O2以保护细胞免受伤害。6-18d,APX、CAT酶活性总趋势降低,推测由于持续的环境胁迫,造成细胞膜脂过氧化程度加深,从而影响了细胞内蛋白质等物质的合成。4、以新疆大叶、北林201为实验材料研究0-72h抗氧化酶基因APX、CuZnSOD、MnSOD和抗病相关基因PAL、NPR1、NPR1L的相对表达量变化规律。根据qRT-PCR分析结果显示,苜蓿叶片中APX、MnSOD、PAL基因的相对表达量显著增加,不同抗感病苜蓿的MnSOD、CuZnSOD、NPR1、NPR1L基因相对表达量变化差异显著,推测这些基因参与了紫花苜蓿对链格孢菌的早期抗性反应。
【图文】：

斑点病,苜蓿

用真菌核糖体内转录间隔区通用引物ＩＴＳ邋１邋（５＇ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧ４（５，－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’邋）（Ｗｈｉｔｅ邋ＴＪ．Ｂｒｕｎｎｓ邋Ｔ．ｅｒ邋ａ／．，１９９０）、孢特异引物邋ＯＰＡ２－１Ｒ邋（５’邋－ＴＧＣＣＧＡ邋ＧＣＴＧＴＣＡＧＡＴＡＡＴＴＧ－３’）和邋Ｏ－ＧＣＣＧＡＧ邋ＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＴ－３’）进行邋ＰＣＲ邋扩增（Ｐｅｅｖｅｒ邋ＴＬ．邋Ｃａｓ邋Ｌ，Ｗ邋“／．，，２００５）。ＰＣＲ邋反应体系为邋２５邋ｌｉＬ，２ＸＴａｑ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋１２．５ｕｌ为ｌｕｌ，上下引物各１邋ｕＬ，ｄｄＨ２０邋９．５ｕｌ。反应程序为９４°Ｃ预变性３ｍｉｎ，０ｓ，邋５６°Ｃ退火３０ｓ，邋７２°Ｃ延伸ｌｍｉｎ，邋３５个循环，７２°Ｃ延伸５ｍｉｎ。逡逑Ｒ产物经１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测。引物由北京天一辉远生物科技，扩增产物送该公司测序，测序结果在ＮＣＢＩ数据库中进行登录和比对果与分析逡逑１．形态学鉴定逡逑地调查苜蓿斑点病发病情况，统计发病率；取苜蓿病叶回实验室进行病显微镜下观察真菌孢子形态进行鉴定（图２－１）。逡逑

电泳图谱,真菌基因,序列鉴定

２．邋３．邋２．邋ＩＴＳ序列鉴定和０ＰＡ２－１序列鉴定结果逡逑以病原菌ＤＮＡ为模板，分别用ＩＴＳ１／ＩＴＳ４引物和ＯＰＡ２－１Ｌ／ＯＰＡ２－１Ｒ引物做ＰＣＲ逡逑扩增，电泳后紫外凝胶成像（图２－２），条带单一较亮，且无非特异性扩增条带，将逡逑ＰＣＲ产物进行双向测序。逡逑Ｍ邋（邋ＩＴＳ邋）（邋ＯＰＡ２－１邋）逡逑７２Ｓ２°逦１：逡逑５００逡逑图２－２真菌基因组的ＤＮＡ电泳图谱逡逑Ｆｉｇ．２－２邋ＤＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇａｌ邋ｇｅｎｏｍｉｃ逡逑通过分析ｒＤＮＡ－ＩＴＳ和ｒＤＮＡ－ＯＰＡ２－１测序比对的结果，基因序列长度分别为逡逑５４７ｂｐ和５９９ｂｐ，将得到的序列导入Ｇｅｎｂａｎｋ中进行同源性比对，发现与链格孢中多逡逑个种的同源性达到９９％以上（表２－１，表２－２）。结合形态学特征确认致病菌是交链逡逑格孢菌如观咖ａ／攸）。逡逑扩增的ＩＴＳ序列结果（５４７ｂｐ）：逡逑ＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＧ逡逑ＧＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴ逡逑ＧＧＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＣ逡逑ＧＴＣＡＧＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡ逡逑ＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧ逡逑ＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡ
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.4

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