苦苣菜黄网弹状病毒运动及超侵染排阻机理研究

发布时间：2020-04-22 22:37

【摘要】：植物弹状病毒(rhabdoviruses)是一类基因组为负链RNA的囊膜病毒(envelopedviruses),广泛为害多种粮食和经济作物,引起严重产量损失。苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus,SYNV)在分类上属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)细胞核弹状病毒属(Nucleorkibabdovirus),是目前研究较为深入的植物弹状病毒。SYNV在细胞核内复制,病毒粒子从内核膜(inner nuclear membrane)出芽后富集于核周腔(perinuclearspace)。侵染植物、昆虫、鱼类和脊椎动物等不同寄主的弹状病毒均以3'-N-P-M-G-L-5'的顺序编码五个保守的病毒结构蛋白,且在基因组复制与转录、出芽(budding)和病毒粒子形成等过程具有类似的特性。此外,植物弹状病毒还编码了一个额外的非结构蛋白,即植物弹状病毒扩散侵染所必须的运动蛋白(movement protein,MP)。长久以来由于反向遗传学体系的缺失,学界对于植物弹状病毒的运动机制知之甚少。本研究以实验室构建的植物弹状病毒侵染性克隆为基础,以SYNV为重点研究对象,探索了病毒胞间运动和长距离运动模式,以及超侵染排阻(superinfectionexclusion,SIE)等现象的分子机制。为了明确SYNV胞间运动方式,我们构建一系列SYNV缺失突变体,包括非结构蛋白sc4、病毒基质蛋白(matrix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)以及M蛋白和G蛋白双缺失突变体,并分析了这些缺失突变体病毒的胞间运动能力。研究结果表明,sc4为SYNV的运动蛋白,其缺失导致SYNV丧失胞间运动能力;M、G以及M和G双缺失突变体依然具有有限的胞间运动能力,从而明确了 SYNV的最小运动单位是其病毒核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和RNA聚合酶(Large polymerase,L)蛋白包裹基因组形成的核衣壳(nucleocapsid,NC)。亚细胞定位分析发现,瞬时表达的SYNVsc4蛋白主要定位于本氏烟表皮细胞的细胞周质(cell periphery),在细胞核内也有少许分布。sc4和高尔基体marker ManI-mCherry、ER 内质网的marker GFP-HDEL、细胞骨架微管marker MAP65-RFP以及细胞骨架微丝marker ABD2-GFP均没有显著的共定位。利用抑制蛋白分泌系统和细胞骨架的药物进行处理发现,20μg/ml的布雷非德菌素A(Brefeldin A,BFA)可以通过破坏内质网网腔结构来抑制SYNV胞间运动,而微管抑制剂氨黄乐灵(Oryzalin)和微丝解聚剂拉春库林B(Latrunculin B,Lat B)则对SYNV胞间运动没有影响。与SYNVN、P蛋白一样,sc4也具有体外非特异性结合单链RNA的能力。BiFC和酵母双杂交均发现sc4与主要核衣壳蛋白N和P蛋白存在互作。我们利用弹状病毒SYNV、马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarf virus,PYDV)、水稻黄矮病毒(Rice yellow stunt virus,RYSV)、水稻条纹花叶病毒(Rice yellow stunt virus,RSMV)和番茄黄斑驳相关病毒(Tomato yellow mottle-associated virus,TYMaV)编码的MP,分别成功回补了番茄花叶病毒运动蛋白缺失突变体(ToMV-GFPΔMP)和马铃薯X病毒运动蛋白缺失突变体(PVX-GFPΔp25)的胞间运动,表明弹状病毒的运动蛋白和正链RNA病毒的运动蛋白有功能上的相似性。对SYNV运动蛋白缺失突变体(rSYNV-GFPΔsc4)进行反式互补实验发现,除了其自身编码的sc4运动蛋白,其它弹状病毒如PYDV、RYSV、RSMV和TYMaV编码的MP以及黄瓜花叶病毒(Cucumbber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)病毒编码的MP都无法回补rSYNV-GFPΔsc4的运动。同样的,对于细胞质弹状病毒——TYMaV来说,仅其自身编码的P3可以回补rTYMaV-GFPΔP3的运动,表明弹状病毒胞间运动特异性地依赖于其自身编码的MP。蛋白互作分析表明,SYNV和TYMaV MP仅与自身N蛋白互作,而不与异源N蛋白互作,推测正是这种核衣壳蛋白与运动蛋白间的特异性互作导致异源病毒编码的MP无法回补弹状病毒胞间运动。进一步共表达试验发现,sc4能够帮助SYNVN-P复合体从核内复制位点定位到细胞周边类似PD的结构上,而不能互作的异源病毒MP则无法改变SYNVN-P复合体定位。这些结果表明,弹状病毒MP通过与核衣壳蛋白特异性互作,引导后者胞内和胞间运动。目前对于植物病毒长距离运动的认识主要基于正链RNA病毒的相关研究,而我们对于植物负链RNA包膜病毒长距离运动的方式和机制了解甚少。我们利用SYNV反向遗传学系统对病毒的结构蛋白融合荧光标签,并对SYNV侵染的本氏烟叶柄、茎秆和根部等维管组织进行徒手切片和超薄切片,通过共聚焦显微镜和透射电镜跟踪和观察病毒蛋白以及病毒粒子的组织定位。实验结果表明,SYNV可在韧皮部复制并进行长距离运输;完整的病毒粒子或结构蛋白存在于本氏烟韧皮部和木质部薄壁细胞、甚至木质部导管等组分中,但没有直接的证据表明SYNV完整病毒粒子可以通过植物木质部导管进行长距离运输。超侵染排阻是指初侵染病毒阻止相同的或将近的病毒对该细胞的再次侵染,是一种病毒之间的同源干扰(homologous interference),也被称为交叉保护(cross protection)。利用不同荧光标记的SYNV变体,发现SYNV在细胞水平和器官水平都存在明显的SIE现象,而与亲缘关系较远的PVX之间并没有SIE现象。瞬时表达SYNV M蛋白抑制SYNV侵染,而表达M mRNA则无抑制作用,表明SIE发生在M蛋白水平而不是RNA水平。相应地,SYNVM缺失突变体部分丧失了对同源病毒排阻的能力。进一步分析发现,SYNV M蛋白可以通过与N蛋白的互作抑制基因组复制与转录。MG126L突变体丧失了与SYNV N蛋白互作的能力后丧失了对SYNV转录和复制的抑制能力;同时M蛋白的NLS突变体无法与N蛋白在细胞核内发生强烈互作,也丧失了对SYNV转录和复制的抑制能力。这些结果表明,初次侵染的SYNV经复制后期大量表达的M蛋白通过与包裹基因组RNA的N蛋白互作,抑制病毒的基因组复制和转录,从而导致再次进入细胞的同源病毒无法复制和侵染。本文利用SYNV反向遗传学体系,深入研究了 SYNV的运动蛋白sc4的性质以及SYNV在胞内、胞间和长距离运动上的特性;发现了 SYNV存在的SIE现象,并揭示了 SYNV诱发SIE现象的背后机制。本论文研究结果有助于深入理解植物负链RNA病毒运动和侵染等分子机制,为该类病毒病害的防控提供理论支撑。
【图文】：

病毒粒子,形态结构,核心蛋白,包膜

逦１绪论逡逑状结构，成熟的病毒粒子具有包膜，长约２４８纳米（ｎｍ），直径约７０邋ｎｍ（图１．１）。逡逑ＳＹＮＶ的最小侵染单元是它的核衣壳复合体（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ，邋ＮＣｓ）邋（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１５）。ＮＣｓ结构由病毒的ＲＮＡ链以及核心蛋白两部分组成，其中核心蛋白分别逡逑是指邋ＲＮＡ邋聚合酶大亚基（ｌａｒｇｅ邋ｓｕｂｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，邋Ｌ）、淲蛋白（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ，逡逑Ｐ）和核衣壳蛋白（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎ）邋（Ｈｅａｔｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９８７，邋Ｗａｇｎｅｒ邋＆邋Ｊａｃｋｓｏｎ，邋１９９７）。逡逑在ＳＹＮＶ病毒粒子中，基质蛋白（Ｍａｔｒｉｘ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋Ｍ）包围着病毒核心ＮＣｓ结构，逡逑在Ｍ蛋白外部是一层寄主来源的包膜结构，包膜表面镶嵌着病毒编码的糖蛋白逡逑复合体（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ

序列,聚合酶,弹状病毒,终止信号

ＳＹＮＶ作为细胞核弹状病毒属（Ｍ／ｃ／ｅｏｒ／？ａ６ｄｏｖ／ｍｓ）的成员，它的转录和复制逡逑都在细胞核中进行，这也是细胞核弹状病毒与细胞质弹状病毒的最大区别。逡逑ＳＹＮＶ的转录遵循顺序转录和极性转录两个规则（图１．３）。聚合酶复合体从病毒逡逑基因组的３’端起始转录，按照ｌｅａｄｅｒ－Ｎ－Ｐ－ｓｃ４－Ｍ－Ｇ－Ｌ的顺序依次转录形成ｌｅａｄｅｒ逡逑ＲＮＡ和病毒各个基因的ｍＲＮＡ，称之为顺序转录（Ａｂｒａｈａｍ邋＆Ｂａｎｅｒｊｅｅ，邋１９７６）；逡逑而ｍＲＮＡ的产量依次递减这一特点，称之为极性转录。指导上下游基因转录终逡逑止和起始的顺式作用元件保守地分布于各个基因之间，称之为ＳＹＮＶ基因间隔逡逑区序列。该序列由三部分组成，分别是转录终止信号“ＡＵＵＣＵＵＵＵＵ”、非转录逡逑双核苷酸信号“ＧＧ”以及转录起始信号“ＵＵＧ”。当聚合酶复合体移动到基因间逡逑隔区上游基因的转录终止信号时，上游基因的合成终止，，并在连续Ｕ的指导下，逡逑为产物ｍＲＮＡ的３’端被加上ｐｏｌｙ邋（Ａ）尾巴；聚合酶在基因间隔区上移动至双核逡逑苷酸信号“ＧＧ”时，约３０％聚合酶复合体从模版上解离，其余的聚合酶继续向逡逑前移动直到遇到下游基因转录的起始信号“ＵＵＧ”时起始下游基因的转录。有证逡逑据显示
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41

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