Cry1Ai蛋白杀虫活性的定向改造
发布时间：2020-04-23 04:17
【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thutingiensis,Bt)因其产生的多种杀虫活性物质而被广泛应用于害虫防治中。本研究中所使用的Cry1Ai2和Cry1Ah1为本实验室发现的对多种鳞翅目害虫均存在良好杀虫活性的蛋白。前期研究结果表明Cry1Ai与Cry1Ah蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和家蚕(Bombyx mori)的活性均存在显著差异,而将Cry1Ah蛋白的loop2换到Cry1Ai蛋白(LC_(50)500μg/g)相应位置后获得的突变体Cry1Ai-h-loop2对棉铃虫的生物活性显著提升(LC_(50)=64.23μg/g),将loop2和loop3同时替换后获得的Cry1Ai-h-loop23对棉铃虫的活性进一步上升(LC_(50)=8.61μg/g)。在此基础上,本研究的主要内容主要包括两方面,首先以突变体Cry1Ai-h-loop2为出发材料,分析找到loop2上的关键位点,再对这些位点定点突变,分析突变体对棉铃虫的杀虫活性变化;其次分析Cry1Ai蛋白domain II上loop2和loop3在对家蚕杀虫活性中发挥的作用,同时测定关键loop区域的替换突变体对家蚕和其它鳞翅目害虫的杀虫活性。本研究的主要结果如下:1.通过丙氨酸突变和对棉铃虫的杀虫活性测定后发现,Gly~(373)和Asn~(375)位点是Cry1Ai-h-loop2蛋白loop2上的关键位点。将这两个位点同时替换为丙氨酸后,双点突变体对棉铃虫的杀虫活性和与棉铃虫中肠刷状缘膜囊泡的结合能力均显著下降。2.对功能位点Gly~(373)和Asn~(375)进行另外18种常见蛋白质氨基酸的替换突变后,未发现对棉铃虫活性显著提高的突变体,说明这个loop上的氨基酸序列可能是最佳的天然组合。3.通过测定Cry1Ai、Cry1Ah以及两种蛋白domain II上loop区域突变体对家蚕的杀虫活性后发现,Cry1Ai蛋白的loop2不决定蛋白对家蚕的杀虫特异性,而loop3对蛋白杀虫活性的发挥十分重要,且loop2和loop3对家蚕杀虫活性的变化具有相加作用。同时,将Cry1Ai蛋白的loop2和loop3同时替换后,突变体Cry1Ai-h-loop23对家蚕的活性降低了17倍,差异显著。综合本实验室之前的研究结果(Cry1Ai-h-loop23蛋白对棉铃虫具有很高的杀虫活性),根据作用机理的基础进行蛋白的定向改造后,我们最终获得了对棉铃虫杀虫活性提高、对家蚕活性下降的突变体蛋白—Cry1Ai-h-loop23。4.通过ELISA结合分析证明:突变体Cry1Ai-h-loop23与家蚕BBMV的结合能力下降,这可能是蛋白活性下降的原因之一,同时说明loop2和loop3参与蛋白与家蚕BBMV的结合中。5.突变体Cry1Ai-h-loop23对小菜蛾仍具一定的杀虫活性,但与Cry1Ai蛋白的活性相比,突变体的杀虫活性显著降低。本研究鉴定了对棉铃虫活性显著上升的突变体Cry1Ai-h-loop2上的关键位点,同时分析了Cry1Ai蛋白上与家蚕杀虫活性相关的loop区域,并筛选到对家蚕活性显著下降的Cry1Ai蛋白突变体。这些研究将为Cry蛋白的杀虫机理研究奠定了坚实的基础,同时也为安全、高效、特异的Cry蛋白的理性设计与定向改造提供了新的思路。
【图文】：
士学位论文 第一章 引 言芽胞杆菌概述芽胞杆菌的特征杆菌属于革兰氏阳性菌，在菌体的生长周期中能产生芽胞和伴胞环境中普遍存在，可从昆虫、土壤、储藏品及尘埃、污水和植被菌在发现之初被认为是一种昆虫病原物，并且发现它的杀虫活性., 1998）。伴胞晶体也称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins一种杀虫蛋白——包括 Cry 蛋白和 Cyt 蛋白。一旦昆虫摄入蛋白解并被中肠蛋白酶活化，活化后的蛋白与中肠细胞膜的特定受体死亡（Bravo et al., 2007）。
图 1.2 苏云金芽胞杆菌的功能介绍（Jouzani et al., 2017）Figure 1.2 The known functions of Bt (Jouzani et al., 2017).2 Cry 蛋白简介2.1 Cry 蛋白的杀虫活性与分类Cry 蛋白是一种由苏云金芽胞杆菌产生的伴胞晶体蛋白，其特点为对靶标生物体存在实验上证实的生物活性，并且与已知的 Cry 蛋白具有一定序列相似性的蛋白质也可称作 Cry 蛋白Crickmore et al., 1998）。自 1981 年 Schnepfh 等人利用 DNA 重组技术从库斯塔克亚种 HD-1 菌中克隆出第一个杀虫晶体蛋白基因起（Schnepf and Whiteley, 1981），至 2018 年 5 月，已获得命的 cry 基因共计 802 个（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）。现行的 Cry白命名法则由 Crickmore 等人提出，即蛋白的命名只考虑不同 Cry 蛋白间的氨基酸序列相似性不考虑其杀虫谱的相似性。一种 Cry 蛋白的名称由 4 个等级构成，1 级使用阿拉伯数字表示且似性要小于 45%，2 级使用大写英文字母表示且相似性要在 45%-78%之间，3 级使用小写英文母表示且相似性要在 78%-95%之间，4 级使用阿拉伯数字表示且相似性要大于 95%（Crickmoreal., 1998）。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476
本文编号：2637344
【图文】：
士学位论文 第一章 引 言芽胞杆菌概述芽胞杆菌的特征杆菌属于革兰氏阳性菌，在菌体的生长周期中能产生芽胞和伴胞环境中普遍存在，可从昆虫、土壤、储藏品及尘埃、污水和植被菌在发现之初被认为是一种昆虫病原物，并且发现它的杀虫活性., 1998）。伴胞晶体也称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins一种杀虫蛋白——包括 Cry 蛋白和 Cyt 蛋白。一旦昆虫摄入蛋白解并被中肠蛋白酶活化，活化后的蛋白与中肠细胞膜的特定受体死亡（Bravo et al., 2007）。
图 1.2 苏云金芽胞杆菌的功能介绍（Jouzani et al., 2017）Figure 1.2 The known functions of Bt (Jouzani et al., 2017).2 Cry 蛋白简介2.1 Cry 蛋白的杀虫活性与分类Cry 蛋白是一种由苏云金芽胞杆菌产生的伴胞晶体蛋白，其特点为对靶标生物体存在实验上证实的生物活性，并且与已知的 Cry 蛋白具有一定序列相似性的蛋白质也可称作 Cry 蛋白Crickmore et al., 1998）。自 1981 年 Schnepfh 等人利用 DNA 重组技术从库斯塔克亚种 HD-1 菌中克隆出第一个杀虫晶体蛋白基因起（Schnepf and Whiteley, 1981），至 2018 年 5 月，已获得命的 cry 基因共计 802 个（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）。现行的 Cry白命名法则由 Crickmore 等人提出，即蛋白的命名只考虑不同 Cry 蛋白间的氨基酸序列相似性不考虑其杀虫谱的相似性。一种 Cry 蛋白的名称由 4 个等级构成，1 级使用阿拉伯数字表示且似性要小于 45%，2 级使用大写英文字母表示且相似性要在 45%-78%之间，3 级使用小写英文母表示且相似性要在 78%-95%之间，4 级使用阿拉伯数字表示且相似性要大于 95%（Crickmoreal., 1998）。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 王泽宇;周子珊;何康来;束长龙;宋福平;张杰;;亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白的交互抗性分析[J];中国生物防治学报;2015年06期
，本文编号：2637344
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