籽用南瓜蔓枯菌遗传多样性分析及潜在致病基因挖掘

发布时间：2020-05-01 19:14

【摘要】：籽用南瓜是南瓜属(Cucurbita)食用种子的栽培种,是黑龙江省的主要经济作物之一。近年来,随着其种植面积不断扩大,连作现象多有发生,导致蔓枯病发生严重,对籽用南瓜产业的发展造成严重影响。蔓枯病是由蔓枯菌侵染而形成的,蔓枯菌属于亚隔孢壳属(Didymella),其发病快,易大面积传播、蔓延,常造成瓜类作物产量和品质的大幅下降。然而,籽用南瓜蔓枯菌的优势种群和致病基因不明,严重影响防治效果。鉴于此,2012年至2016年期间,对黑龙江省籽用南瓜主产区进行了实地调研,采集了籽用南瓜蔓枯病病叶,在分离病原菌的基础上,结合形态学与ITS序列,进行了籽用南瓜蔓枯菌的遗传多样性分析,利用高通量测序技术获得了全基因组信息,分析了侵染寄主前、后的转录本差异表达,试验结果表明:获得形态差异明显的籽用南瓜蔓枯菌30株,利用ITS序列鉴定其均为Stagonosporopsis cucurbitacearum(Sc.),由此推断Sc.为该地区主要的籽用南瓜蔓枯菌种群。综合菌落颜色、形态、生长速率等方面存在的差异,将籽用南瓜蔓枯菌分为7种形态学类型,分别命名为Ⅰ型-Ⅶ型。筛选出Sc.最适生长条件:pH值为6.0,生长温度为25℃,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为蛋白胨。通过基因组序列多位点系统进化分析,上述30株菌株可分为两种基因型(基因型A和B),并分析这些菌株的ITS保守基序,发现该病原菌具有两个共有基序(common motifs),不同小种间仅存在共有基序之外的序列差异。保守基序的确定为快速、准确地检测Sc.,诊断蔓枯病早期症状提供数据参考。构建了Sc.代表菌株zq-1的cDNA文库,通过PacBio RS II测序,获得5.24Gb高质量基因组数据,并将原始数据过滤和质量控制数据进行了三代组装,获得Sc.的全基因组序列,基因组大小为35.28 Mb,预测含有9844个基因。其中,基于Rfam数据库识别到82个家族的257个非编码RNA,1024个含有信号肽的蛋白,2066个跨膜蛋白和756个分泌蛋白;利用CAZyme、TCDB和PHI专有数据库预测的分泌蛋白数目分别为605、130、2869个;识别6-mA甲基化位点30833个,4-mC DNA甲基化位点1228069个。获得的Sc.基因组组装及注释信息,为全面深入解析该真菌的基因组信息提供依据。Sc.与Leptosphaeria maculans(Lm.)菌株在基因组长度(35.28 Mb vs.45.12 Mb)、蛋白编码基因数量(9844 vs.12469)等方面都较为相似,推测这两个菌种存在较近的亲缘关系或在进化阶段很接近。通过共线性分析,获得菌株Sc.和Lm.的相似基因,为进一步揭示Sc.的潜在基因功能、阐明物种进化关系和探究基因组的内部结构奠定基础。采用RNA-seq高通量测序技术,开展了Sc.侵染籽用南瓜前、后基因差异表达分析,共获得44.62Gb的高质量转录组测序数据(Q30碱基百分比在92.38%及以上),单个基因进行功能注释并根据基因在不同样品中的表达量,识别差异表达基因341个,其中上调基因170个,下调基因171个。对上述差异表达的基因进行GO功能注释以及KEGG通路分析,预测52个可能为致病基因,其中34个基因涉及水解酶、蛋白激酶、磷酸酶、纤维素酶等多个分子功能,15个基因涉及生物学进程,3个基因与MAPK通路、ABC转运蛋白、细胞内吞作用相关,这些基因很可能在蔓枯菌的生长和致病过程发挥重要作用。
【图文】：

序列,研究方向,基因组,转录组

图 1-1 基于 RNA-seq 技术的不同研究方向Fig.1-1 Different research directions based on RNA-seq techno是一套从整个 RNA 分子中提取 cDNA 序列，然后构建文库和基因表达具有时间依赖性、细胞依赖性和刺激依赖性，许多位-seq 允许在特定的发育阶段或特定的治疗条件下量化每个转录此外，RNA-seq 允许以一种相当公正的方式分析转录组，具有态检测范围和低背景信号。与基于杂交的技术相比，它不仅可询问，而且还可以应用于尚未装配完整参考基因组的物种。R发展的过程，包括测序技术的发展、实验设计和算法开发。与不断涌现。存在大量成熟的工具来满足 RNA-seq 数据分析的取映射。年里，RNA-seq 在基因组、表观基因组和转录组的表征和量化一代测序（NGS）技术摆脱了以往技术的诸多限制，如阵列技叉杂交背景、信号饱和引起的检测动态范围限制等。此外，这率下产生大而复杂的数据集，而且成本不断下降，因此它为更基因组提供了可能。RNA-seq 是使用第二代测序方法以确定重复性高、定量准确、分析可靠、应用范围广、价格便宜等特

流程图,测序技术,信息分析,实验流程

图 1-2 SMRT 测序技术的实验流程及信息分析流程[88]Fig.1-2 Experimental and information analysis procedures of SMRT sequencing technology获得物种的基因组数据之后，通过对基因的详细解析，，才能形成研究结果，所以基因的功能预测是不可或缺的，由此加速了生物信息学的发展和应用，早先这一学科主要用于基因组学和蛋白质组学，之后扩展到转录组学和代谢组学。生物信息学是一门新兴的学科，以核酸和蛋白质序列为基础，通过序列信息的比对，来预测未知基因并分析基因结构和功能。构建数据库是生物信息学分析的重要环节，根据具体的分析目的来构建相应的数据库，一般情况使用公共数据库平台就可以进行分析，包括：美国国家生物技术信息中心 NCBI（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）、日本信息生物学中心 DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/ ）和欧洲核酸序列数据库 EMBL（http://www.ebi.ac.uk/），这三大平台信息全、范围广、更新快，受到众多科研人员的青睐。随着基因组学研究的不断深入，加快了生物信息学的发展，各种功能因子相关的数据库和生物软件的开发，这又促进了植物病原真菌基因组的解析。目前，病原菌基因组生物信息学分析常用的工具有：Pfam（蛋白质家族）数据库、PHI（病原体宿主交互）数据库、CAZy（碳水化合物相关酶）数据库、TCDB（转运蛋白）数据库、Kin Base（蛋白激酶）数据库、MEROPS（肽酶）数据库、Conserved Domains（保守结构在线）分析平台、G-protein- coupled receptor（G-蛋白偶联受体）数据库等。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.429

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