红棕象甲芳基硫酸酯酶B基因的克隆及其在体外免疫中的功能解析

发布时间：2020-05-01 03:32

【摘要】：昆虫在受到微生物胁迫时会通过表皮屏障或产生外分泌物来阻止环境中的病原菌对自身造成影响。这是一种异于昆虫体内免疫的免疫防御机制,被称之为体外免疫防御策略。许多昆虫都能够合成并分泌出一些具有特殊用途的化学物质,这些化学物质在昆虫的生存、繁衍和扩散中发挥着重要作用,也是研究昆虫免疫系统的重要部分。醌类是赤拟谷盗体外免疫分泌物中重要组成部分,而芳基硫酸酯酶B(arylsulfatase B,ARSB)能够调节醌的合成,并影响分泌物的抑菌活性。红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus是我国一种重大入侵有害生物,主要危害棕榈科植物,给我国南方的棕榈种植造成了巨大损失。为了更好地运用生物防治的手段来控制红棕象甲,本文研究了ARSB基因对红棕象甲体外免疫分泌物中的对苯醌含量和分泌物抑菌活性的影响,明确其体外免疫效能与红棕象甲对环境中病原菌耐受度之间的关系等。本文运用金龟子绿僵菌小孢变种Metarhizium anisopliae var.anisopliae胁迫的方法对红棕象甲的体外免疫进行了诱导,并对诱导后产生的分泌物进行活性分析,重点测定其对抑菌活性、苯醌含量以及芳基硫酸酯酶B基因表达量的影响等。据此确定红棕象甲中ARSB和对苯醌浓度与抑菌活性之间的关系,进而评估ARSB基因对体外免疫效能的影响。同时,使用RNA干扰技术沉默ARSB基因,检测红棕象甲分泌物的抑菌活性和对苯醌含量变化等,得到了以下结果:1.红棕象甲三个ARSB基因均在唾液腺组织中高表达。ARSB-0311基因、ARSB-11581基因和ARSB-14322基因在唾液腺中的相对表达量比在其它组织(头部和体壁)中的相对表达量分别高出5倍、6倍和8倍以上。2.在使用金龟子绿僵菌对红棕象甲幼虫胁迫24 h后,幼虫的口腔分泌物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制活性显著增强,大肠杆菌菌液24 h内的OD_(600)值增长量比胁迫前下降了20%;金黄色葡萄球菌24 h内的OD_(600)值增长量比胁迫前下降了14%。对金龟子绿僵菌的抑菌圈直径(14.50±0.29 mm)显著大于未胁迫组的抑菌圈直径(10.33±0.88 mm)。这表明红棕象甲在受到病原菌胁迫后,会增强自身分泌物的抑菌活性,而分泌物中对苯醌的含量无显著变化。3.在进行金龟子绿僵菌胁迫红棕象甲24 h后,ARSB-0311基因在头部、体壁的相对表达量均显著增加,分别为胁迫前的33倍和16倍,在其他组织的相对表达量没有显著差异。ARSB-11581基因在头部、体壁的相对表达量也均增加,分别为胁迫前的3倍和9倍,而在唾液腺中的相对表达量降低了63%。ARSB-14322基因在唾液腺、脂肪体中的相对表达量分别下降了94%和92%,在其他组织相对表达量无显著变化。这表明病原菌的胁迫可以显著影响唾液腺中ARSB基因的表达量。4.在干扰12 h后,相较于未干扰的分泌物对大肠杆菌的抑菌效果,干扰ARSB-14322基因后的分泌物抑制活性显著增加,菌液OD_(600)值24 h的增量下降了45%;干扰ARSB-0311和ARSB-11581基因后分泌物抑制活性无显著变化。对金黄色葡萄球菌的抑制效果表明,干扰ARSB-0311基因后分泌物抑制活性显著增强,金黄色葡萄球菌菌液OD_(600)值24 h的增量下降了25%;干扰ARSB-14322基因后,菌液OD_(600)值24 h的增量下降了48%;干扰ARSB-11581分泌物抑制活性无显著变化。干扰红棕象甲ARSB-14322基因会增强其自身分泌物的抑菌活性,同时导致分泌物中对苯醌含量降低。从上述结果可以知道病原菌胁迫可以引起ARSB基因表达量的变化,且ARSB-14322基因的表达量变化也会改变分泌物的抑菌活性以及对苯醌的含量,这表明ARSB基因可以调控红棕象甲的体外免疫反应,对研究其体外免疫机制及防控策略有重要意义。然而ARSB基因的调控机制尚不明确,有待进一步研究。
【图文】：

21图 2-1 红棕象甲 ARSB-0311 基因全长和氨基酸序列注：红色圆点示O-糖基化位点Fig. 2-1 Nucleotide and amino acid sequence of ARSB-0311 in R. ferrugineusNote: Putative O-linked glycosylation sites is labled with red dots.

有信号肽序列，，无跨膜结构域，含有 5 个 N-糖基化位点和 6 个 O 糖基化位点（图2-2）；ARSB-14322 编码 561 个氨基酸，有信号肽序列，无跨膜结构域，含有 5 个N-糖基化位点和 5 个 O 糖基化位点（图 2-3）。ARSB-0311 和 ARSB-11581 的核心功能结构域为磷酸二酯酶和硫酸酯酶结构域，ARSB-14322 的核心功能结构域为硫酸酯酶结构域。3 个 ARSB 基因均属于芳基硫酸酯酶家族的碱性磷酸酶和硫酸酯酶超家族。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S763.38

【参考文献】

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本文编号：2646503