贵州省烟草主产区马铃薯Y病毒株系划分及致病力分析

发布时间：2020-05-01 00:33

【摘要】：马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus),是最大植物RNA病毒种类之一,可侵染马铃薯、番茄、辣椒、烟草等多种经济作物,给农作物造成产量损失。基于PVY与马铃薯抗性基因的识别关系可区分为:PVY~O、PVY~C、PVY~Z、PVY~N、PVY~E,其中PVY~N可引起烟草叶脉坏死。根据PVY基因组内是否存在重组分为非重组型和重组型分离物。近期新发现的PVY分离物大都属于重组型,暗示PVY种群由最初的PVY~O、PVY~N等非重组型分离物转变为重组型分离物。本研究对贵州省烟草主产区疑似病毒病侵染的样品进行血清学、生物学及分子生物学分析,初步了解侵染贵州省烟草的主要病毒种群结构,发现PVY重组株系PVY~(NTN-NW)成为田间发病的优势株系。通过分析不同嵌合体病毒移动和积累水平变化及在不同寄主上侵染性,明确了影响PVY的致病性的相关区域。具体结果如下:(1)鉴定了危害贵州省烟草的病毒种类。利用小RNA高通量测序技术,分析贵州省烟草样品混样中病毒的种类,结果发现危害贵州省烟草的病毒种类有烟草脉带花叶病毒(TVBMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、野生番茄花叶病毒(WTMV)、辣椒环斑病毒(ChiRSV)5种,其中尤以PVY、TVBMV危害严重。(2)分析危害贵州烟草PVY分离物的株系情况。利用血清学方法对贵州烟草主产区采集的35个疑似病毒病样品进行检测,发现PVY检出率为57.1%。将PVY阳性样品接种普通烟,发现6个分离物仅表现花叶症状,14个分离物表现坏死和花叶症状。基于P1/HCpro编码序列的系统进化分析发现,本研究获得的20个分离物中,6个分离物与N株系代表性分离物N-605|X97895聚集在P1HC-II组,6个分离物与O株系代表性分离物O-139|U09509共同聚集在P1HC-III组,其余8个分离物与SYR-II-2-8|AB461451等重组型分离物聚集在一组;基于CP编码序列的系统进化分析发现,本研究获得的全部分离物与ShX14|KJ634024、O_Z|EF026074等分离物聚集在一起。重组分析发现8个分离物在P1编码区域存在重组事件。结合PVY基因组结构分析,明确危害贵州省烟草的PVY主要包含重组株系PVY~(NTN-NW)及非重组株系PVY~O,且重组株系PVY~(NTN-NW)为田间发病的优势株系。(3)PVY基因组的2480 nt-5852 nt参与症状形成和病毒积累。通过分段扩增和同源重组的方法,将侵染性克隆PVY~N605、分离物PVY~O和PVY~(SYRII)相应基因组替换pCamPVY~(SYRI)-GFP侵染性克隆相应区域,获得嵌合体PVY-A(NONN)、pCamPVY~(SYRII)-GFP、PVY-B(NOOO)和PVY-C(NNNO)。接种上述嵌合体到本氏烟,发现PVY-C(NNNO)与PVY~N605-GFP发病症状严重程度相似,二者的病毒积累水平相似且显著高于其它嵌合体。分析嵌合体基因组结构及其生物学症状发现,PVY基因组2480nt-5852nt序列(编码P3中间区域及C端区域、6K1、CI、6K2、VPg N端区域的蛋白)与症状严重程度和病毒积累水平有关。接种后第七天PVY~(SYRII)-GFP在系统叶片积累水平提高,显著高于PVY-A(NONN)和PVY~(SYRI)-GFP。比较pCamPVY~(SYRII)-GFP与pCamPVY~(SYRI)-GFP序列差异仅存在于5’UTR、P1、HCpro、P3的N端,表明该区域序列具有增强病毒积累水平的能力。(4)PVY基因组2480nt-5852nt是决定PVY侵染辣椒的关键区域。将含有PVY不同嵌合体的本氏烟系统发病叶片,通过机械摩擦接种马铃薯品种Shepody、Favorita和Desiree,发现上述PVY嵌合体均能系统侵染马铃薯。同样通过机械摩擦接种辣椒品种特大牛角王和台湾特大948牛角,发现PVY~(SYRI)-GFP、PVY-A(NONN)、PVY~(SYRII-)GFP能够系统侵染,而PVY~N605-GFP、PVY-C(NNNO)不能系统侵染辣椒。比较PVY不同嵌合体的基因组结构及生物学特性,发现PVY基因组2480nt-5852nt(编码P3中间区域及C端区域、6K1、CI、6K2、VPg N端的蛋白)是决定PVY能否系统侵染辣椒的关键区域。(5)PVY基因组5’端编码区与病毒移动、积累有关。PVY~(SYRI)型分离物CN:GZ23:16和pCamPVY~(SYRI)-GFP侵染性克隆在基因组的5’端序列上存在差异,将CN:GZ23:16分离物的5’端序列(5’UTR、P1、HCpro、P3的N端)替换pCamPVY~(SYRI)-GFP侵染性克隆中相应区域,获得嵌合体pCamPVY~(SYRI-5N)-GFP。将上述分离物接种本氏烟,发现二者在浸润叶片荧光强度、病毒积累水平、病毒移动速度均低于PVY~N605-GFP。嵌合体PVY~(SYRI-5N)-GFP在病毒细胞间移动、系统移动速度快于PVY~(SYRI)-GFP,且表现明显矮化症状,表明PVY基因组5’端编码区参与病毒移动、积累及症状形成。
【图文】：

实验流程,测序,酸定,蛋白核

-2FD、SW-CJ-1BU 苏净安泰码照相机（80D，Canon）、体式、振荡仪（QL-901Vortex 海门、蛋白核酸定量测定仪（瑞典恒科学仪器）、电子天平（MEt）、超纯水机（Simplicity U似样品，通过 TransZolUp 方法通过 RT-PCR 扩增及 PAGE 胶备后续测序分析（图 2-1）。

生物信息,分析流程

图 2-2 生物信息分析流程Fig. 2-2 Biological information analysis process烟草样品中 PVY 检测及其生物学性状VY 抗血清通过间接 ELISA 方法对贵州采集的病毒病疑似样品进5 侵染的普通烟作为阳性对照，健康普通烟为阴性对照。在阳性时读数，样品 Abs405值为阴性对照两倍时判定样品为 PVY 为阳Y 血清学阳性烟草样品分别置于磨样袋中，按照 1：5（质量体积磨，通过汁液摩擦接种至 4-6 周普通烟 NC89。选取普通烟完全金刚砂，用无针头注射器吸取研磨液置于待接种叶片，，摩擦接种干净，对照组用超纯水摩擦接种。定期观察接种后普通烟症状。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41

【参考文献】