温度和JH通过热休克因子协同调控棉铃虫卵黄原蛋白的表达

发布时间：2020-05-02 15:48

【摘要】：棉铃虫(Helicoverpa armigera)属于鳞翅目、夜蛾科,是重要农业害虫,危害包括棉花、玉米、辣椒在内的200多种农作物,每年造成大量的经济损失。棉铃虫产卵量大,单只雌虫在自然状态下平均产卵1426粒,最多达21738粒。环境温度变化可以显著影响棉铃虫的产卵量,其中25℃-30℃最为适宜。卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)的合成是昆虫产生大量成熟卵的前提基础,也是昆虫生殖调控研究的重要科学问题,包括棉铃虫在内的许多昆虫,Vg合成是由保幼激素(juvenile hormone,JH)调控。Vg在JH作用下在脂肪体内大量合成并由血淋巴运送到卵巢,最终以卵黄蛋白(vitellin,Vn)的形式储存于卵母细胞。但是,对环境温度和JH如何协同调控Vg表达和卵黄发生的分子机理缺乏了解。本论文前期研究发现,热休克因子(Heat shock factor,HSF)参与环境温度和JH对Vg表达的协同调控,但其中的分子机制有待深入研究。本论文以棉铃虫雌性成虫为实验材料,取羽化后正常发育6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的脂肪体样本,Western blot检测结果显示HSF和Vg表达量呈正相关。体内JH类似物(JHA)处理发现,JH可以诱导脂肪体内Vg的合成。通过RNAi干扰HSF后,Vg的转录水平和蛋白水平都显著下降,卵巢发育和卵母细胞成熟受到显著抑制;另外,HSF RNAi显著抑制JH诱导Vg的表达,以上结果表明HSF参与JH信号通路调控Vg表达。构建HSF过表达载体并转染至果蝇细胞系中,JH诱导后发现,HSF磷酸化水平随着诱导时间的延长而增加,而且JH通过PKA催化HSF磷酸化;为了进一步确定PKA催化HSF磷酸化,PKA抑制剂H89在细胞诱导前加入细胞中,结果发现,H89显著抑制JH诱导的HSF磷酸化,该结果表明JH激活PKA催化HSF磷酸化。HSF的亚细胞定位发现,在15℃条件下,HSF主要分布在细胞质和细胞核中;27℃条件下HSF向细胞核内运动,并且在一定温度下经过JH诱导后HSF亚细胞定位没有变化。对Vg启动子区序列进行分析后发现,其存在6个HSF可能的结合位点,结合双荧光素酶报告实验,发现ATTCCATTCA可能是HSF的结合序列。启动子活性实验发现,RFP-His表达量随着JH浓度梯度的增加和JH时间梯度的延长而增加;而且过表达HSF能显著增强JH诱导的RFP-His表达,表明HSF能够增强Vg启动子的活性。本论文首次以HSF为切入点,从分子机制上解析了环境温度和JH对Vg表达的协同作用,首次发现HSF在发挥基因调控功能上既响应环境温度的变化,也响应JH滴度的变化。JH通过PKA触发HSF磷酸化,适宜的环境温度(例如27℃)促进HSF入核。HSF结合Vg基因上游含有ATTCCATTCA的DNA序列上调Vg的转录。研究结果丰富了对JH和环境温度调节昆虫Vg表达和生殖力的分子机制的了解。
【图文】：

产卵量,棉铃虫,温度变化,虫子

图 3-1 温度变化对棉铃虫产卵量以及 Vg 和 HSF 表达量的影响（A）横坐标为五组温度，15℃、18℃、21℃、24℃、27℃。纵坐标为每对虫子的平均产卵量着温度的升高棉铃虫的产卵量也随着增多。（B）横坐标为五组温度，15℃、18℃、21℃、24℃7℃，纵坐标为 Vg 和 HSF 的表达量。Vg 和 HSF 的表达量随着温度的升高而升高。

序列,启动子区,结合位点,在线预测

图 3-2 Vg 启动子区的结合位点利用 Gene Regulation 网站在线预测了 Vg 启动子区的结合位点。3.3 棉铃虫 Vg，Actin 和 HSF 抗体特异性检测根据棉铃虫 Vg、Actin 和 HSF ORF 序列，利用 Primer Premier 5.0 软件设计了含有
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.622.3

【参考文献】