γb蛋白抑制细胞自噬和活性氧迸发促进大麦条纹花叶病毒侵染的分子机制研究

发布时间：2020-05-10 08:31

【摘要】：自噬(autophagy)是一种保守的细胞内物质(蛋白质、细胞器等)降解通路,在动物病毒和植物DNA病毒侵染过程中通常具有防御功能,与此同时,许多动物病毒也进化出一些逃避降解或者干扰自噬活性的反防御策略以利于病毒自身的侵染。植物RNA病毒是否也存在类似的干扰自噬的反防御策略目前尚不明确。活性氧(reactive oxygen species,ROS)的迸发通常会抑制病原物的入侵,但其与病毒侵染之间的关系尚不十分清楚。大麦条纹花叶病毒(Barleystripemosaicvirus,BSMV)是一种ss(+)RNA病毒,它编码的γb蛋白在病毒侵染过程中有多种重要的功能。因此,本研究拟在确认Yb与寄主蛋白(ATG7和GOX)直接互作的基础上,阐明γb蛋白通过抑制自噬途径和活性氧迸发促进BSMV侵染的分子机制,明确γb蛋白的更多未知新功能。根据BSMV侵染的本生烟(Nicotiana benthamiana)中自噬相关基因的转录水平和自噬小泡的数量均显著降低、而自噬流指示蛋白(NBR1)的积累量却显著上升等实验结果,首次发现植物RNA病毒(BSMV)的侵染抑制了自噬的发生,γb蛋白是BSMV抑制自噬的关键因子,其抑制自噬和抑制RNA沉默的功能是相互独立的。γb与自噬通路的关键蛋白ATG7在体内和体外均可直接互作,其中γb蛋白的Y29是互作的关键氨基酸。通过体内Co-IP、体外竞争性pull-down实验和对ATG8/ATG8-PE的检测,证明γb-ATG7的互作比ATG8-ATG7更强。因此,当BSMV侵染时,γb竞争性地干扰了 ATG7和ATG8的相互作用并影响了 ATG8与PE分子的结合,γb是通过抑制自噬来促进BSMV的侵染。沉默ATG5和ATG7基因可增加BSMV的积累并加重症状、瞬时表达的ATG7蛋白抑制病毒侵染,这些结果证明自噬在BSMV的侵染过程中同样具有抗病毒作用。不与ATG7互作的γbY29A突变体丧失了抑制自噬的功能,突变体病毒BSMVY29A的症状减弱、病毒积累量降低,表明在植物防御和病毒反防御的军备竞赛中ATG7是新发现的一个病原物效应子的靶标。利用DAB和NBT染色的方法分别对叶片中过氧化氢(H202)和超氧化物(O2-)进行检测,首次发现BSMV侵染本生烟时抑制了 ROS的迸发,通过瞬时表达BSMV不同蛋白,证明γb蛋白是抑制ROS的关键因子。利用双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down和分子筛凝胶过滤等方法,证明过氧化物酶体乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)与γb在体内和体外直接互作。酶活检测结果显示,γb蛋白在体内和体外均能抑制GOX的酶活,进而破坏了过氧化物酶体的氧化还原状态,抑制了过氧化物酶体中ROS的迸发。沉默GOX基因会导致寄主的ROS代谢发生紊乱,BSMV的侵染也会受到明显的抑制。当BSMV侵染时,γb蛋白通过与GOX的互作直接抑制GOX的酶活,调控过氧化物酶体中产生的ROS到适宜的水平,既促进病毒侵染又维持受侵染植株能正常生长。综上所述,γb蛋白抑制细胞自噬和活性氧迸发以促进BSMV病毒侵染,该现象的发现及其分子机制的阐明,为深入理解病毒的侵染机制、及多功能γb蛋白在寄主防御和病毒反防御的博弈过程中的新功能提供了新的科学证据。
【图文】：

模型图,自噬,类型,模型

根据发生过程和底物的差异，细胞自嗤0Ｊ以分为微自嗤（ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）、巨自嗤逡逑（ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）以及分子伴侣蛋白介导的自唾（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，邋ＣＡＭ）邋（Ｂａｓｓｈａｍ逡逑ｅｔａｌ．，邋２００６：Ｂ0ｙａｅｔａｌ．，２０ｎ）（图１－１）。由液泡膜或者溶酶体膜直接内陷形成小的泡状结构，将细逡逑胞内的物质降解即为微自噬（ＢａｓｓｈａｍｅｔａＬ邋２００６）；分子伴侣蛋白介导的自噬同样发生在液泡膜逡逑或者溶酶体膜上，但是这类蛋白的降解需要借助分子伴侣的作用将其转运至液泡或溶酶体中，例逡逑如，具有类ＫＦＥＲＱ多肽结构的蛋白可以被Ｈｓｐ７０蛋白识别，同时Ｈｓｐ７０可以与溶酶体膜蛋白逡逑ＬＡＭＰ－２Ａ蛋白相互作用，从而将带有ＫＦＥＲＱ序列的蛋白运输至溶酶体中发生降解（Ｂｏｙａ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１３）；巨自噬即通常提到的自噬

互作,复合物,文献综述,雷帕霉素

中国农业大学博士学位论文逦第一章文献综述逡逑（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ），可与邋ＡＴＧ９邋蛋白互作（Ｘｉｅ邋ａｎｄ邋Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，２００７；邋Ｙａｎｇ邋ａｎｄ邋Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，逡逑２００９）。ＡＴＧｌ８邋可以与邋ＰＩ３Ｐ邋（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）以及邋ＰＩ３Ｐ２邋（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３，５－逡逑ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）互作，与ＰＩ３Ｐ的互作可以保护ＡＴＧ８－ＰＥ复合物使其免受ＡＴＧ４的错误剪切（Ｎａｉｒ逡逑ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。逡逑（ＩＩＩ）邋ＰＩ３Ｋ邋复合体（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－３－ｋｉｎａｓｅ，ＰｔｄＩｎｓ３Ｋ邋ｃｏｍｐｌｅｘ）。ＡＴＧ６／Ｂｅｃｌｉｎｌ邋和逡逑ＰＩ３Ｋ／ＶＰＳ３４复合体参与到自噬小体的成核过程（Ｈａｙｗａｒｄ邋ａｎｄ邋Ｄｉｎｅｓｈ－Ｋｕｍａｒ，２0ｌ邋ｌ）0逡逑
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41

【参考文献】