根癌农杆菌介导柑橘指状青霉突变体库的扩建及其致病性分析

发布时间：2020-05-10 13:10

【摘要】：由指状青霉引起的绿霉病是柑橘采后最严重的真菌性病害之一。目前柑橘防治还是以化学防治为主,然而化学药剂的环境污染、农药残毒量及抗药病原菌的出现都迫使我们去寻找更安全的防治方法。因此研究柑橘指状青霉的致病机理,对其更好防控具有重要的理论和应用价值。实验通过根癌农杆菌介导指状青霉转化体系,建立扩大转化子突变体库。对筛选出的不致病突变株P44-14-44,从生理水平分析其与野生菌株的表型差异,在分子水平上确定导致表型变化的突变基因,针对突变基因进行定点敲除,分析基因功能。主要研究结果如下:1、突变体库的扩建。通过农杆菌介导指状青霉转化已获得1000多个转化子,能在潮霉素上稳定生长,经过随机PCR验证均能扩增出潮霉素磷酸转移酶基因。2、比较突变株与野生株的生理水平差异。(1)对突变株与野生株分别进行扫描和透射电镜观察。扫描电镜下,观察到野生株明显的帚状结构,突变株只有菌丝体,没有帚状结构。透射电镜下,野生株分生孢子细胞结构完整,细胞壁、隔膜、细胞膜及内部的细胞器明显,突变株细胞壁外围明显加黑加粗;(2)测量了接种突变株与野生株柑橘表面的p H。将无菌水、野生菌和突变菌孢子悬浮液分别接种到温州蜜柑和纽荷尔脐橙,用平面p H计测量伤口表面p H,接种野生菌温州蜜柑伤口处第三天p H从5.5下降到3.9,纽荷尔脐橙伤口p H从5.3下降到3.3,但是接种突变菌的和接种无菌水的结果保持一致,都没有明显的变化;(3)分析野生菌与突变菌的生长速率与孢子产量,培养第8 d时,野生菌菌苔的生长直径是突变菌的5倍,第13 d时野生菌菌苔直径是突变菌的近4倍,野生菌的孢子数量是突变菌的近7倍,发现突变菌的生长速率和孢子产量都明显低于野生菌。3、突变株分子水平解析。(1)通过重测序技术确定了突变菌的T-DNA拷贝数与插入位点,测序结果与之前的Southern blot和Tail-PCR结果保持一致。突变菌有3个T-DNA拷贝插入,有2个T-DNA插入导致两个基因发生突变,分别命名为269、275基因,还有一个T-DNA插入位点位于两个基因间隔区;(2)针对两个突变基因269、275,通过基因敲除的方法研究突变基因与指状青霉致病性之间的关系。
【图文】：

2 实验材料与方法2.1 试验材料2.1.1 试验菌株及质粒N1 为本实验室分离保存的指状青霉；P44 为意大利巴里大学 Antonio Ippolito教授惠赠的指状青霉菌株；P44-14-44 为本实验室筛选出来接种柑橘后完全不致病的指状青霉突变株；用于转化敲除的根瘤农杆菌类型为 AGL-1；大肠杆菌感受态 trans 5α（北京全式金），分别保存在-80℃冰箱中。转化过程中所需的质粒是 pTFCM, 其含有 T-DNA 插入臂序列，转化过程中重要的抗性筛选标记是潮霉素 B 抗性基因 hph，其由构巢曲霉的强启动子 PtrpC启动和强终止子 TtrpC 终止。基因敲除的原始质粒为 pCAMBIA1300-HPH，以此构建出 269、275 基因敲除质粒 pCAMBIA1300-HPH-△269、pCAMBIA1300-HPH-△275。

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位论文 结果与分析3.1 指状青霉对潮霉素敏感性检测在进行转化实验之前，检测野生指状青霉对潮霉素抗生素的敏感性，确定筛选浓度。通过24孔板筛选，筛选浓度梯度分别为0、5、10、15、20和40 μg/m个浓度梯度 A-D 4 个试验重复，当潮霉素浓度达到 10 μg/mL 时，已经完全了指状青霉的生长，经过多次试验重复，发现 10 μg/mL 的潮霉素均能抑制长，，结果稳定。综合考虑到后期转化试验过程中既减少假阳性概率，又提效率，最终确定的转化筛选浓度为 50 μg/mL。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66

【参考文献】

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本文编号：2657351