铜离子激发拟南芥免疫机制的研究

发布时间：2020-05-10 22:48

【摘要】：铜是生物必需的微量元素,是多种酶的辅因子,如细胞色素c和铜锌超氧化物歧化酶等。缺少铜将影响生物的生长,导致生长迟缓甚至死亡。在植物中,铜离子还参与光合作用、电子传递和植物激素乙烯的识别等过程,影响植物多个生长发育进程。作为一种重金属离子,铜离子对微生物具有毒性。铜离子能够抑制孢子的萌发,使细菌和真菌的酶丧失活性。因此,在农业生产中,铜制剂被用于防治多种植物病害,以减轻病害导致的损失。近两百年来,以“波尔多液”为代表的铜基杀菌剂被广泛应用于农业生产,在防治多种植物病害中发挥了重要功能。尽管在农业生产中已经发现许多病原微生物对铜具有耐受性,但喷施铜基杀菌剂仍然能够有效防控病害,这一现象暗示铜离子除了通过重金属毒性直接杀伤病原微生物外,还可能存在其它病害防控途径。基于其它重金属离子如镉等能激发植物免疫的事实,我们提出铜离子是一种激发子的假说,并围绕铜激活的植物免疫反应和分子机制进行了研究。以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(Pseudomonas syringae pv tomato DC3000,DC3000)为对象,对铜离子激发拟南芥的免疫机制进行了探索。获得如下结果:(1)发现喷施低于影响DC3000生理浓度的硫酸铜(100μM或低至10 nM时),仍然能增强拟南芥对DC3000的抗性。通过比较硫酸铜、氯化铜、硫酸镁之间的差异,明确铜离子是增强拟南芥抗病性的因素。(2)发现喷施铜离子可以激活拟南芥一系列的抗性生理反应,包括丝裂原活化蛋白激酶的快速磷酸化、活性氧类物质和胼胝质的积累、PR1等多个病程相关基因的上调表达。通过拟南芥突变体证实铜离子激发的抗病性依赖乙烯和水杨酸信号途径。(3)对硫酸铜处理2小时和24小时的拟南芥进行RNA-seq分析,并同已发表的鞭毛蛋白氨基端保守序列flg22和延伸因子EF-Tu(elf26)触发的拟南芥表达谱进行比较分析。发现铜离子引起的差异表达基因(DEGs)有517个与flg22或elf26介导的差异表达基因相同,其中370个为共同上调表达的基因,暗示铜离子触发的植物免疫非常类似PAMP分子触发的PTI(PAMP-triggered immunity)。(4)从RNA-seq数据中挖掘到多个乙烯生物合成相关基因受到铜离子的诱导表达。包括编码乙烯合成限速酶基因ACS2、ACS6、ACS7、ACS8、ACS11等;气相色谱技术测定乙烯积累量也发现,铜离子处理30分钟即可显著地提高拟南芥的乙烯合成速率,且在处理1-2小时内乙烯合成速率达到峰值;进一步利用拟南芥突变体分析表明,acs8单突变体响应铜离子2小时的乙烯积累量明显降低,铜离子介导的对DC3000的抗性消失;而在acs2-1/acs6-1双突变体和acs1/2/6/4/5/9/7/11八突变体中无明显变化,阐明了铜离子激发的抗病性依赖于ACS8基因。(5)为解析铜离子激活ACS8基因的转录机制,用本生烟瞬时表达和拟南芥转基因对ACS8基因的启动子进行了分析。将ACS8基因编码区上游1665 bps序列截短后连接GFP基因,确定编码区上游-1155至-901区域存在铜离子响应元件;结合生物信息学预测分析的结果,推测该区域中的CUP2转录因子结合的顺式作用元件CuRE(copper response element,序列aagaagaaaaa)可能起主要作用;将CuRE顺式作用元件与35S mini基础启动子融合,驱动GFP基因在烟草叶片中瞬时表达,证实该元件可以响应铜离子激发的信号;转基因拟南芥材料实验结果同样证明CuRE顺式作用元件在ACS8基因响应铜离子的上调表达中是必需的。(6)为解析拟南芥感知铜离子并传递信号的上游分子机制,我们对拟南芥细胞膜上铜离子转运子开展研究。采用RNAi策略分别沉默了拟南芥COPT1、COPT2、COPT3、COPT4、COPT5基因,发现沉默COPT 1、2、3、5基因的转基因拟南芥依然能够响应铜离子增强对DC3000的抗性,而在沉默COPT4基因的转基因拟南芥中,铜离子增强的抗病性明显减弱,其激发的防卫相关基因PR1、ERF1的表达量以及胼胝质积累量也减弱。用GUS报告基因分析了COPT4的组织表达模式,发现COPT4主要在拟南芥的根、茎以及叶片的维管束中表达,其具体的功能还有待进一步揭示。综上所述,本研究揭示了铜离子可以激发拟南芥产生依赖于乙烯和水杨酸、类似PTI的植物抗性,揭示了“铜基”农药在直接抑菌之外的新机制,为铜制剂的广谱性和持久性特点做了新的注释。首次揭示了铜离子通过CuRE顺式作用元件诱导ACS8基因的表达,促进乙烯快速合成的分子机制,该结论对于揭示铜制剂产生的“果树落叶”以及“幼果药害”等现象的分子机制提供了理论基础。同时本研究发现COPT4在铜离子激发的拟南芥免疫反应中发挥重要功能,为后续铜离子感知和传递机制的研究奠定了基础。
【图文】：

硫酸铜,拟南芥,抗性,细菌数量

山东农业大学博士学位论文结果与分析.1 铜离子提高拟南芥对 DC3000 的抗性.1.1 硫酸铜抑制 DC3000 在拟南芥叶片中的增殖100 μM 硫酸铜喷施处理拟南芥，处理 4 小时后，注射接种浓度为 106cfu/ mLOD600=0.002）的 DC3000，接种 3 天后，观察拟南芥发病情况。硫酸铜处理的拟南无论是黄化程度还是坏死面积都显著低于对照（图 1A）；统计拟南芥叶片中的C3000 细菌数量，对发病程度进行定量分析，结果如图 1B 所示，0 天时，两种处理拟南芥叶片中的细菌数量无显著性差异（P > 0.05）；而接种 3 天后，与对照相比，酸铜处理过的拟南芥叶片中细菌数量降低了 95.93%（P < 0.01）（图 1B）。

细菌生长曲线,硫酸铜,氯化铜,拟南芥

图 2硫酸铜、氯化铜、硫酸镁和水处理拟南芥的细菌生长曲线Fig.2 Growth of DC3000 in Arabidopsis leaves treated with CuSO4, CuCl2, MgSO4or H2O低于 100 μM 的硫酸铜不抑制 DC3000 在培养基上的生长离子抑制 DC3000 在拟南芥叶片中的增殖（图 2），，推测出现这种现象的离子直接和 DC3000 接触，对 DC3000 产生毒性，抑制 DC3000 繁殖；也激发了拟南芥的防卫反应，利用拟南芥体内的防卫系统抑制病原菌。为作用方式，首先开展铜离子对 DC3000 的抑菌实验。结果如图 3A 所示，离子浓度位于 0-200 μM 的浓度范围内时，铜离子对 DC3000 的生长没有铜离子浓度进一步增大到 500 μM 时， DC3000 不能在培养基上增殖（图固体培养基中，200 μM 硫酸铜对 DC3000 的增殖没有明显抑制。此之外，本研究还统计了 DC3000 在含铜液体培养基中的生长情况，结μM 硫酸铜培养液中 DC3000 在各个时间点的吸光度值和对照相比无显著
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.2

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