核桃JrWRKY4和JrWRKY21转录因子对胶胞炭疽菌侵染响应的研究

发布时间：2020-05-13 22:15

【摘要】：核桃(Juglans regia L.)是重要的干果树种,随着核桃栽培面积的快速增加,由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的核桃炭疽病(anthracnose)严重发生,导致果实坏疽脱落,造成核桃产量和品质的重大损失,同时危害嫩梢和叶片,造成树体衰弱甚至死亡,是目前核桃产业发展的灾难性病害。WRKY是植物中一类非常重要的转录因子,参与植物抗病反应及其信号转导途径。本实验以抗病品种‘瑞嘉’为材料,克隆核桃JrWRKY4和JrWRKY21,研究了其对胶孢炭疽菌侵染的响应。主要结果如下:1、从PlantTFDB 4.0数据库下载核桃WRKY转录因子,筛选了71个核桃WRKY转录因子,并通过Ex PASy Proteomics Server在线软件预测了核桃WRKY的等电点、分子量等。MEGA 5.0软件对核桃WRKY转录因子家族进行系统进化分析,参考拟南芥(Arabidopsis thaliana)WRKY转录因子家族的分类,将核桃WRKY转录因子分为III类(I、II、III):第I类含有13个WRKY转录因子,每个转录因子都含有2个WRKY保守结构域;第II类含有49个WRKY转录因子,第II类又可细分为IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5个亚类,其中IIa亚类有5个,IIb亚类有8个,IIc亚类有16个,IId亚类有12个,IIe亚类有8个;第III类由9个WRKY转录因子组成。2、以抗病核桃品种‘瑞嘉’为材料,设计引物克隆了核桃JrWRKY4(GM519616)和JrWRKY21(GM519618.1)转录因子。JrWRKY4开放阅读框全长1554 bp,编码517个氨基酸,含有两个WRKY保守结构域,锌指结构为C_2H_2型,与樱桃(Prunus avium)WRKY4(AGW17296.1)同源性达71.16%,属于WRKY家族的第I类;JrWRKY21开放阅读框全长1035 bp,编码344个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,锌指结构为C_2H_2型,与樱桃WRKY21(XP 021821911.1)同源性达82.02%,属于WRKY家族的II d亚类。3、实时荧光定量PCR检测了核桃不同组织器官中JrWRKY4和JrWRKY21的表达情况。结果表明,JrWRKY4和JrWRKY21在不同组织中均有表达,但不同组织之间存在明显的差异。JrWRKY4和JrWRKY21均在成熟叶片中表达量最高。4、利用胶孢炭疽菌孢子液侵染核桃叶片,检测了侵染0、3、6、12、24、48、72h后JrWRKY4和JrWRKY21的表达变化。结果发现,JrWRKY4和JrWRKY21表达量的变化趋势是一致的,在6 h表达量达到最高值,JrWRKY4在6 h达到了初始的28倍,JrWRKY21达到了63倍。随后表达量开始下降,并低于对照。这表明JrWRKY4和JrWRKY21可能参与核桃炭疽病胁迫的早期响应。5、分别构建了pPZP211-JrWRKY4-GFP和pPZP211-JrWRKY21-GFP植物融合表达载体,通过农杆菌介导法瞬时表达本生烟(Nicotiana benthamiana)叶片,于双光子激光共聚焦显微镜下进行定位观察,结果发现JrWRKY4和JrWRKY21蛋白均定位于细胞核中。6、在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中异源转化核桃JrWRKY4和JrWRKY21,对转基因拟南芥进行炭疽病抗性鉴定。结果发现,在胶孢炭疽菌侵染后,超表达JrWRKY4和JrWRKY21的转基因拟南芥株系与野生型相比,炭疽病发病的时间较晚,同时期症状较轻。JrWRKY4和JrWRKY21均可显著增强拟南芥对胶胞炭疽菌的抗性。
【图文】：

转录因子

图 1 WRKY 转录因子保守结构域（引自 Rushton，，2010）Fig.1 WRKY transcription factor conserved domains1.1.2 WRKY 转录因子的进化

曲文,炭疽病,核桃,不同部位

8图 2 核桃炭疽病不同部位发病症状（引自曲文文，2011）A：果实发病症状；B：叶片发病症状；C：枝干发病症状Fig.2 Symptoms of anthracnose in different organs of walnutA: Symptom on fruit; B: Symptom on leaves; C: Symptom on branc
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.64

【参考文献】