芳香化合物受体（AhR）信号通路调控飞蝗对毒死蜱敏感性的机制研究

发布时间：2020-05-14 07:13

【摘要】：芳香化合物受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)是胞质中的一种配体结合型的转录因子,主要参与对有毒物质的代谢反应,近几年研究表明,转录因子AhR参与昆虫对多种杀虫剂抗药性的形成。本实验以东亚飞蝗为实验材料,利用RNAi技术,同时基于飞蝗转录组数据,探究飞蝗LmAhR的代谢解毒调控机制,为寻找防治害虫新标靶和新型杀虫剂的研发提供新方法和新思路。本研究的主要内容如下:1.干扰飞蝗芳香化合物受体(LmAhR)基因影响飞蝗对杀虫剂的敏感性本研究首先克隆得到LmAhR基因的全长序列;并通过基本生物信息学技术对其进行了序列分析及蛋白质的结构特征分析;通过RT-qPCR技术分析其在不同组织部位和不同发育龄期的表达模式;利用RNAi技术沉默LmAhR基因,检测飞蝗对四种典型杀虫剂的敏感性。结果表明:LmAhR cDNA全长为4,010 bp,由11个外显子和10个内含子组成,编码842个氨基酸,预测蛋白质分子量91.65 kDa,理论等电点为8.13,AhR蛋白从N端到C端主要由b-HLH结构域、PAS蛋白结构域和转录激活结构域三部分组成的;系统发育分析表明,飞蝗LmAhR首先与鳞翅目昆虫AhR聚为一支;沉默LmAhR基因后使飞蝗对毒死蜱的敏感性增加,表明转录因子AhR参与飞蝗对毒死蜱的代谢解毒功能。以上研究为阐明飞蝗LmAhR基因功能和东亚飞蝗的新防治方法提供了理论基础,同时也丰富了昆虫抗药性研究的内容。2.飞蝗比较转录组分析进一步探索飞蝗转录因子AhR代谢解毒机制,构建了一种深度测序的飞蝗转录组数据库。测序共得到46.66 GB Clean Data;通过组装,共得到79429条Unigene,序列总长度为71930521bp,N50 Length为1,876 bp,Mean Length为90,560 bp;利用EDGE工具,参照≥2倍的差异,p≤0.05作为截断值,选择处理组和对照之间差异表达的基因,基于该标准,212个基因显示差异表达,其中67个基因的表达下调,而145个基因的表达上调,基于研究目的,我们重点研究下调组基因,并进一步对差异表达基因进行eggNOG功能注释、聚类以及富集性分析;最后用RT-qPCR对转录组数据进行验证,根据测序分析结果我们筛选出了一个典型的解毒酶基因LmGSTd7,因此推测LmAhR可能是通过影响LmGSTd7基因的表达参与飞蝗的代谢解毒作用。3.飞蝗LmGSTd7基因对毒死蜱的敏感性机制研究根据上述转录组分析结果,本章进一步探索GSTD7解毒酶与四种杀虫剂的代谢反应。首先利用RT-qPCR技术分析LmAhR和LmGSTd7基因在不同组织部位和不同发育龄期的表达模式,结果表明飞蝗LmAhR和LmGSTd7基因在检测的组织中均有表达,LmGSTd7和LmAhR基因的组织表达谱相似,在大脑和血淋巴中的表达量相对较高;LmAhR基因在飞蝗一龄若虫期的表达量最高,在飞蝗二龄至四龄若虫期有较高的表达,而LmGSTd7在飞蝗的卵期的表达量最高,在三龄和五龄若虫期的表达量相对较高。利用RNAi技术沉默LmGSTd7基因,检测飞蝗对不同杀虫剂的敏感性,结果在四种杀虫剂处理后,飞蝗对毒死蜱的敏感性显著性增加,推测转录因子AhR参与LmGSTd7基因的表达从而介导飞蝗对毒死蜱的代谢作用。采用原核表达技术,将LmGSTd7在BL21(DE3)中表达,经Ni-NTA亲和蛋白纯化后,成功获得飞蝗GSTD7蛋白,为后续体外农药代谢实验奠定基础。
【图文】：

芳香化合物受体（AhR）信号通路调控飞蝗对毒死蜱敏感机制研究上述浓度。采用点滴法，参照上述 2.1.8 方法注射双链，24 h 后于三龄若虫腹部第二、三体节点滴 3 μL，24 h 后统计飞蝗的死亡率，本实验设置实验组和对照组，对照组点滴丙酮，每个实验组设置 5 个生物学重复，每个生物学重复 11 头三龄若虫。2.2 实验结果2.2.1 飞蝗 LmAhR 基因的克隆利用本课题组已有的东亚飞蝗转录组数据库，，以 “Aryl hydrocarbon receptor”为关键词搜索飞蝗转录组 Nr 注释库，获得一条飞蝗 LmAhR 基因的待定全长序列，利用 RT-PCR 法获得飞蝗 LmAhR 基因全长 cDNA 序列，全长 4,010 bp，其中开放阅读框为 2,529 bp，5′端非编码区长 130 bp，3′端非编码区长 1,351 bp。由 11 个外显子和 10 个内含子组成。（如图 2-1）

图 2-2 LmAhR 的结构域示意图Fig.2-2 Schematic diagram of deduced domains of LmAhR残基，HLH：螺旋-环-螺旋结构域，PAS：PER-ARNT-SIM 结构域，富含 H:富，P / S：富含脯氨酸/丝氨酸的区域。图 2-3 飞蝗 LmAhR 蛋白 N-端的三维分子结构
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.2;S482.3

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本文编号：2663010