实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用

发布时间：2020-05-20 06:50

【摘要】：莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科莲属多年生宿根水生草本植物,是我国重要的特色水生蔬菜。莲藕中含有丰富的营养物质,受到国内外消费者的喜爱。在我国莲藕主产区,发生地下茎瘦小僵硬、表面出现深入皮层的黑褐色点斑和条斑的“僵藕”问题,前期研究表明,“僵藕”极有可能是由病毒侵染引起的。目前,已报道的在莲藕上发生的病毒主要有:莲藕潜隐病毒(暂定名)(Lotus latent virus,LLV),黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、莲藕条斑病毒(Lotus streak virus),芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)。本实验室前期在对上述病毒的初步研究中发现LLV的发生最普遍,分布最广泛,但该病毒的稳定的检测技术尚未建立。为此,本论文研究了基于实时荧光定量和等温核酸扩增的该病毒的检测技术体系,并利用该检测技术研究了 LLV在莲藕中的分布。主要结果如下:1、建立了 RT-qPCR、LAMP和RPA 3种LLV检测体系,其中,RT-qPCR检测体系灵敏度最高,最低检测限度为7×10~1拷贝.μl~(-1),是RT-PCR的100倍,适用于脱毒莲藕种苗的检测鉴定;LAMP检测体系最低检测限度为7×10~3拷贝·μl~(-1),与RT-PCR一致,且具有可视化特点,适用于田间诊断;RPA检测体系反应时间短,速度快,最低检测限度为7x10~3拷贝·μl~(-1),可作为大量莲藕样品检测时的有效手段。2、利用灵敏度最高的RT-qPCR检测技术,分别对“僵藕”样品不同部位进行LLV定量检测。结果发现,LLV在“僵藕”顶芽后第一节地下茎中浓度最高,并且逐节递减。对“僵藕”做种后新结莲藕的地下茎的表皮层、气孔周围基本组织、维管束组织以及中央薄壁细胞的检测发现,在维管束和气孔周围基本组织中LLV的浓度显著高于表皮层及中央薄壁细胞。
【图文】：

示意图,莲藕,取样部位,潜隐病毒

７５０邋＇逡逑图２－２莲藕潜隐病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测结果逡逑Ｍ：分子量标记；Ｐ：阳性对照；Ｎ：阴性对照逡逑１－８：顶芽、茎１、节１、茎２、节２、茎３、节３、茎４逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＬＬＶ邋ｂｙ邋ＲＴ－ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｐ：邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｎ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑１－８：邋ａｐｉｃａｌ邋ｂｕｄ，邋ｓｔｅｍ邋１，邋ｎｏｄｅ邋１，邋ｓｔｅｍ邋２，邋ｎｏｄｅ邋２，邋ｓｔｅｍ邋３，邋ｎｏｄｅ邋３，邋ｓｔｅｍ邋４逡逑表２－５莲藕潜隐病毒序列比对结果逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－５邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＬＬＶ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ逡逑分离物名称逦序列覆盖率Ｅｉ；邋相似度逡逑Ｉｓｏｌａｔｅ邋ｎａｍｅ逦Ａｃｃｅｓｓ

示意图,莲藕,潜隐病毒,RT-PCR检测

扬州大学硕士学位论文。逡逑３逦５逦７逡逑１逡逑２逦４逦６逦８逡逑图２－１莲藕取样部位示意图逡逑１－８：顶芽、茎１、节１、茎２、节２、茎３、节３、茎４逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｌｏｔｕｓ邋ｒｏｏｔ邋ｓａｍｐｌｉｎｇ邋ｓｉｔｅ逡逑１－８：邋ａｐｉｃａｌ邋ｂｕｄ，邋ｓｔｅｍ邋１，邋ｎｏｄｅ邋１，，邋ｓｔｅｍ邋２，邋ｎｏｄｅ邋２，邋ｓｔｅｍ邋３，邋ｎｏｄｅ邋３，邋ｓｔｅｍ邋４逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.45

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