柑橘黄龙病菌噬菌体遗传多样性和SOS应答转录调控因子表达特性分析

发布时间：2020-05-20 08:00

【摘要】：柑橘黄龙病(HLB)是威胁全球柑橘产业健康发展的毁灭性病害,由于HLB病菌尚无法获得离体纯培养,因而导致其生物学特性、遗传变异规律、致病分子机制及病害流行规律等方面的研究均未取得突破性进展。HLB菌全基因组序列的公布为开展HLB菌遗传多样性研究、寻找基因变异位点和种群分化等研究提供了理论参考。本研究对我国柑橘黄龙病菌原噬菌体多样性和SOS应答(SOS response,SOSr)转录调控因子方面开展了系统研究,获得的主要研究结果如下:1.通过对来自中国不同地理来源的234份确定为HLB阳性的样品进行噬菌体种类鉴定,发现SC1和SC2噬菌体普遍存在于本研究所收集的6个不同地理来源的黄龙病菌分离物中,包括广东长春花(Catharanthus roseus)分离物和江西赣州脐橙(Citrus sineses Osbeck cv.)分离物、福建永春芦柑(Citrus madurensis Lour)分离物、湖南宜章脐橙(Citrus sineses Osbeck cv.)分离物、广东果树所砂糖橘(Citrus reticulate Blanco cv.)分离物、云南保山柠檬(Citrus limon(L.)Osbeck)以及北沙水柠檬(Citrus limon(L.)Osbeck)和海南琼中绿橙(Citrus sinensis Osbeck cv.)分离物。在所有样品中SC2检出率达到96.15%,而SC1噬菌体检出率为55.56%,低于SC2噬菌体的检出率。进一步通过对菌株CLas str.UF506中原噬菌体SC2胶原三螺旋重复(Collagen triple helix repeat,Cthr)蛋白特异基因进行扩增和序列比对发现,在云南柠檬分离物中有多条带共存现象,且比例达到81.08%;其它地理来源样品中少数也存在多条带共存现象,大部分分离物以单一条带为主,且相较于其他含有多条带的样品,云南柠檬分离物中的多条带亮度均一,无明显主带、次带之分,经分析发现造成序列出现差异的原因是cthr基因中存在一个18 bp的微型跳跃转座子序列,该微型跳跃转座子序列规律性插入两个相邻的GAGGTCCTT或TAGGTCCTT与GAGGTCCTT之间,其重复数介于1~22个不等。通过系统进化分析证实所有云南柠檬分离物与美国长春花样品聚为一簇,均与GenBank中原噬菌体CLas str.UF506(登录号:HQ377374)中的SC2(登录号:HQ377373)聚为同一分支;而其他地理来源样品同代表菌株CLas str.gxpsy(登录号:CP004005)和CLas str.A4(登录号:CP010804)含有的噬菌体聚为一簇,证实了云南HLB样品含有的噬菌体具有更丰富的遗传多样性。2.通过对LexA_(CLas)基因的扩增和克隆测序验证,明确了我国CLas分离物中不含有LexA保守结构域。结合噬菌体相对表达量进一步对全基因组范围内内22个转录调控因子及延伸因子(EF-Tu)和SOSr激活蛋白(RecA)相关基因应答SOS处理时的差异表达进行了系统的分析,处理包括丝裂霉素C(Mitomycin C,MMC)处理、紫外线(UV)处理和热处理。结果证实:上述24个转录调控相关基因中NusG、CarD、NusA、RS8、MraZ和EF-Tu为有明显差异表达的基因。对这些基因进行进一步的qRT-PCR分析发现:1)MMC处理样品中,当MMC浓度为15μg/mL处理1.5 d时噬菌体表达量最高,转录调控因子CarD和MraZ此时同样上调表达,所以很有可能代替LexA响应SOSr。2)UV处理样品中,辐射0 min~30 min时在10 min和30 min时呈现上调调表达,其他时间点均为下调表达,而转录调控因子RS8、EFTu、MraZ、RS1和RS9呈现出相同的表达趋势,所以很有可能共同作用响应SOSr。3)热处理样品中,当温度为25°C时均呈现下调表达,当温度为37°C时样品中噬菌体随着时间的延长表达量呈现先升高后降低的趋势,且均呈上调表达,且表达量达到14~30倍,转录调控因子NusG、NusA、CarD、RS8、MraZ和EFTu均在25°C处理2 d和37°C处理时均呈上调表达,所以很有可能共同作用响应SOSr。综合上述结果,对三种SOS诱导处理均有应答的调控因子有CarD和MraZ,很有可能在响应SOS应答中起主要作用。
【图文】：

图 1.1 柑橘黄龙病的症状特点Fig. 1.1 Symptoms caused by citrus Huanglongbing bacteria (图：徐国亮，拍摄时间：2016.6~2017.31.2.2 黄龙病命名及危害柑橘黄龙病在我国发现已久，最早在潮汕地区当地人称“黄梢病”，但粤语发音类似于“黄龙病”，之后在世界各国陆续有发现相似症状但命名各不相同( Obergolzer et al 1965, Aubert et al 1985, Graca 1991)，随着研究者对 HLB 的病原和寄主的认识逐渐深入，直到 1995 年召开的第十三届国际柑橘病毒学会（IOCV）会议才正式命名为黄龙病（Huanglongbing, HLB）(Bové2006, 范国成等 2009)。由于目前尚无特效药剂和抗病品种，该病的防治仍然十分困难，如果被 HLB 感染，切实可行的办法是挖除病树并及时销毁。浙江台州 2002 年首次遭受 HLB 入侵，但由于没有引起足够的重视及缺乏有效的防控措施，至 2016 年病情严重，全市共挖除具有明显症状病树 500 多万株，给当地柑橘产业造成了毁灭性的灾害，后来对成片柑橘

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文胁迫并对 DNA 造成损伤或复制受阻形成暴露单链 DNA（single stranded DNDNA）时，大量 ssDNA 的聚集导致 RecA（recombinase A）变成一种激活状态ssDNA结合形成RecA-ssDNA核酸蛋白复合物，促使阻遏蛋白LexA二聚体降解而 SOS 相关基因启动，导致包括 RecA 和 LexA 在内的大约 30 个对 DNA 损伤修复的SOS蛋白被诱导表达(Schmidt andChamberlin 1984, Kuzminov 1999, Na al 2001, 周庆等 2007)，这是一种变异率极高的易错修复方式，可以使细胞存活加，突变率也增加。当修复完成后，RecA-ssDNA 复合物分解，，RecA 活性减到诱导表达的基因恢复到本底水平，LexA 重新积累并结合在 SOS 基因启动子的双链 DNA 上，从而 SOS 相关基因表达再次受到抑制(Witkin 1976)，如图 1.。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66

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