OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析

发布时间：2020-06-01 03:05

【摘要】：水稻内寄生线虫是水稻重要的病害之一,受线虫侵染的水稻在地上部分通常无明显症状,但是,水稻线虫会导致植物生长速度减慢,特别是在水稻生长早期,导致水稻的有效分蘖数明显减少,植株黄化、矮化,根部变成黄褐色甚至腐烂。据统计,全球58%的水稻都受到了潜根线虫的侵染,导致水稻减产25%左右。水稻尖细潜根线虫(Hirschmanniella mucronata)是内寄生线虫的一种,它侵染并寄生在水稻的根部,通过分泌多种效应蛋白来降解或修饰水稻根部细胞壁和改变根部细胞蛋白功能来达到侵染和繁殖的目的。同时,水稻为了抵御线虫的侵染也会主动调节体内代谢水平,激活细胞壁修饰酶基因和防卫基因的表达,诱导产生植物激素等途径来抵抗内寄生线虫的侵染。实验室前期通过转录组测序,比较分析了接种与不接种尖细潜根线虫的水稻根部组织差异表达基因。本实验从差异表达基因中选取了OsGWD1基因,通过克隆该基因并表达出编码的蛋白质来寻找与其相互作用的蛋白,为进一步探究该基因在水稻与尖细潜根线虫互作中的作用,以及探索新的潜根线虫防治策略奠定理论基础。主要研究结果如下:1.扩增目的基因OsGWD1,利用TA克隆技术将该基因克隆转化pEASY-T3载体,获得了重组载体T3:OsGWD1。预测分析OsGWD1基因的开放阅读框为462 bp,共编码153个氨基酸,蛋白分子量大小约为18 KD,等电点(pI)为4.83;属于亲水性不稳定蛋白;该蛋白无信号肽且不含跨膜结构,表明其可能不属于膜蛋白或分泌蛋白;肽链中无规则卷曲所占比例较高,具有7个β片层结构;具有高度保守的WD40-repeat结构域,属于WD40-repeat家族;预测与OsGWD1蛋白可能互作的有10个蛋白并模拟形成了相互作用的关系网络图。2.通过克隆转化得到过表达载体pCAMBIA1302:OsGWD1:GFP,亚细胞定位发现目的蛋白定位于细胞核内。利用Gateway技术将RNAi片段重组至植物干扰载体pB7G,获得了重组RNAi质粒。利用农杆菌转化法将过表达重组质粒以及RNAi质粒转染进入水稻日本晴获得转基因水稻植株,为后续进行水稻潜根线虫接种实验提供了原材料。3.将OsGWD1的orf序列克隆重组进入原核表达载体中pCzn1中。提取阳性重组质粒进入含有分子伴侣pTf16的BL21(DE3)感受态细胞中,与分子伴侣蛋白共表达。经过SDS-PAGE分析和Western Blot验证表明成功表达出了18KD的目的蛋白。0.05 mM的IPTG诱导浓度,16℃诱导表达20 h为最优诱导表达条件。4.通过His-tag pull down获得25个可能与OsGWD1互作的水稻蛋白。GO分析发现,这些基因共富集在20个GO条目中,KEGG富集分析表明这些蛋白富集在12条通路中,主要集中在核糖体、氧化磷酸化和吞噬过程等代谢通路。其中,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、S-腺苷甲硫氨酸转移酶、热休克家族蛋白Hsp70、Hsp73和延伸因子蛋白eEF1A在代谢通路中起着关键作用,对水稻胁迫反应及防卫反应具有重要意义。
【图文】：

图 2-1 转膜放置示意图Fig 2-1 Transfer film placement diagram好的转膜槽放入电泳槽，电泳槽内加入转膜缓冲 mA(电压约 300 V)，转膜时间要根据蛋白的大小后，将转移完毕的 PVDF 膜用 TBS-T 缓冲液轻入封闭液中过夜封闭，消除非特异性条带。封 次，每次 10 分钟。。按 1: 5000 的稀释比例用 5 %的脱脂奶粉稀释稀释液中，4 ℃冰箱过夜孵育。抗。弃一抗，用 TBS-T 缓冲液轻摇洗膜，重复 的稀释比例用 5 %的脱脂奶粉稀释，，再将 PVDF育结束后，加入 TBS-T 缓冲液轻摇洗膜，多重een-20 的目的。 A 液 B 液按 1: 1 混合后，将膜平铺于保鲜膜上 PVDF 膜上避光反应 1 min。在蛋白成像仪中成像并拍照。

图 2-2 pull down 法获取互作蛋白Fig 2-1 Pull down assay to obtain interaction protein蛋白功能注释及分析定到的蛋白进行 GO 功能注释（Gene Ontology）和 genes and genomes）富集分析。GO 数据库收集了丰富组分（Cell component，CC）、分子功能（MoleculBiological proces，BP）三个方面，可以根据实验目的基因的分布情况。由于生物体通过调节各种基因的不同的基因之间依靠相互作用共同完成生长代谢过程、生物化学及系统功能组学等方面信息，通过统计学生物现象相关通路[73]，通过这些通路可以了解候选基功能，主要参与了哪些生理生化代谢以及信号转导途能和阐明相互作用机制奠定基础。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111

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本文编号：2690872