BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究
发布时间：2020-06-08 06:54
【摘要】：家蚕既是重要的泌丝经济昆虫,也是蚕桑产业和历史文化的重要载体。而家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类家蚕病原微生物。Bm NPV是完全的胞内寄生生物,其自身基因组简单,不具细胞结构,通常利用宿主的营养物质和信号通路来完成自身的生命周期。病毒感染宿主细胞会引发宿主的一系列反应,如细胞凋亡、DNA损伤应答、热休克反应和能量代谢等。其中,细胞凋亡作为机体重要的生物学过程,受内外环境变化或凋亡信号触发,其是在基因调控下所发生的清除衰老、多余和受损细胞以维持自身稳定的一种自我调节方式。细胞凋亡几乎存在于所有的多细胞生物,在生物体生长发育、组织分化和细胞免疫维持内环境稳定过程中扮演重要角色。病毒本身随着宿主防御系统进化而协同进化,进而逃逸宿主细胞的抗病毒机制。昆虫缺乏哺乳动物的获得性免疫系统,而细胞凋亡作为其重要的免疫应答组成部分,这对研究病毒与宿主相互作用,及病毒如何利用宿主信号通路来实现自身增殖复制是一个很好的切入点。本研究对家蚕核型多角体病毒凋亡抑制因子Bm NPV iap2基因进行功能鉴定,探究Bm NPV IAP2及其相互作用蛋白在Bm NPV侵染过程中对宿主细胞凋亡调控的机制,初步解析Bm NPV iap2基因在Bm NPV增殖过程中的作用机制,为解析Bm NPV利用Bm NPV iap2基因调控宿主细胞凋亡利于自身增殖提供理论依据。主要研究结果和结论如下:1.Bm NPV iap2基因的功能鉴定通过序列分析发现Bm NPV iap2基因的ORF长750 bp,编码249个氨基酸(aa),预测蛋白质分子量为28.72 k Da,等电点为9.51。蛋白结构域预测表明Bm NPV IAP2从80 aa到153 aa为BIR结构域,202 aa到236 aa为N端RING结构域。系统发生树分析结果显示杆状病毒IAP2主要以α-杆状病毒为主,具有相对较高的保守性,此外,杆状病毒的IAP2与昆虫IAP关系较近(尤以鞘翅目、膜翅目为主),该结果与推测杆状病毒IAP是通过昆虫水平转移相一致。成功构建了BmNPV iap2基因的真核过表达载体和基于CRISPR/Cas9的敲除载体,Bm NPV iap2基因的过表达载体转染家蚕Bm E-SWU1细胞,免疫荧光结果表明Bm NPV IAP2主要定位于细胞质,Western Blotting检测到约30.71 k Da处存在特异性条带;基于CRISPR/Cas9在Bm NPV中成功敲除Bm NPV iap2基因,通过Hoechst染色、TUNEL检测、Caspase活性检测分析和流式细胞术等技术检测显示,在Bm NPV侵染Bm E-SWU1细胞中,敲除Bm NPV iap2基因后细胞核染色质固缩呈典型凋亡小体,与对照相比,敲除Bm NPV iap2基因凋亡小体比例达到20%。此外,与对照相比,TUNEL检测绿色荧光明显增强,Caspase-9和Caspase-3/7活性均显著上升,凋亡细胞比例增加11%,表明Bm NPV iap2经CRISPR/Cas9敲除后引发细胞凋亡;利用q RT-PCR技术和Western Blotting技术,过表达Bm NPV iap2上调病毒基因ie1和vp39表达,促进Bm NPV增殖,敲除Bm NPV iap2下调病毒基因ie1和vp39表达,抑制Bm NPV增殖。2.BmNPV IAP2相互作用蛋白的鉴定为了鉴定Bm NPV IAP2的调控网络,以Bm NPV IAP2为诱饵,进行免疫共沉淀-质谱分析,筛选到Bm NPV IAP2可能的相互作用蛋白Bm PP5和Bm HSP60,通过荧光共定位和免疫共沉淀等方法鉴定其与Bm NPV IAP2的确存在相互作用。Bm PP5从19 aa到120 aa为三个串联TPR结构域,195 aa到471 aa为PP2Ac结构域,可能参与了线粒体细胞周期;HSP60从359 aa到395 aa为Coiled coil结构域,556 aa到572 aa为Low complexity结构域,主要参与蛋白质到线粒体的正确靶向、蛋白质“从头”折叠和热激反应等。成功构建了Bmpp5和Bm Hsp60基因的真核过表达载体及基于CRISPR/Cas9的敲除载体,通过Hoechst染色和Caspase活性检测分析显示,敲除Bm Hsp60、Bmpp5细胞核染色质固缩,呈现典型的凋亡小体,与对照相比,敲除Bm Hsp60、Bmpp5凋亡小体比例分别达到12%和15%。此外,与对照相比,Caspase-9和Caspase-3/7活性均显著上升,说明Bmpp5和Bm Hsp60基因经CRISPR/Cas9敲除后引发细胞凋亡。此外,Bm HSP60在抗病毒方面的研究已经报道,本文着重研究关于Bm PP5的抗病毒功能。通过q RT-PCR技术和Western Blotting技术,过表达Bmpp5上调病毒基因ie1和vp39表达,促进Bm NPV增殖;敲除Bmpp5下调病毒基因ie1和vp39表达,抑制Bm NPV增殖。为进一步探索Bm NPV IAP2相互作用蛋白对Bm NPV IAP2的调控,Bm NPV侵染过程中,在转录水平及蛋白水平利用q RT-PCR和Caspase活性检测分析技术分析,结果表明,过表达Bmpp5上调表达Bm NPV iap2;敲除Bmpp5下调表达Bm NPV iap2。Caspase活性检测分析表明,敲除Bmpp5影响Bm NPV iap2抑制细胞凋亡功能。3.Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同调控宿主细胞凋亡确定Bm NPV IAP2、Bm IAP和Bm PP5两两之间存在相互作用。利用q RTPCR分析Bm NPV侵染过程中Bmiap、Bmpp5与Bm NPV iap2基因的表达模式,结果表明Bm NPV侵染过程中,Bmiap表达下调,Bmpp5与Bm NPV iap2上调表达。为了探究Bm NPV利用Bm NPV iap2调控宿主细胞凋亡机制,通过q RT-PCR和Western Blotting技术在转录水平及蛋白水平研究Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同调控宿主细胞凋亡和Bm NPV增殖复制,结果证明Bm NPV侵染过程中,Bm NPV iap2和Bmpp5上调表达Bmiap;过表达Bm NPV iap2和Bmpp5能增强Bmiap抗H_2O_2诱导的细胞凋亡。此外,过表达Bm NPV iap2和Bmpp5能增强Bmiap引起的促进病毒增殖作用。
【图文】：
成异源复合体，进一步招募起始 Caspase-9 前体，Caspase-9 通过自我剪切进行活化，活化后的起始 Caspase 进一步激活下游执行 Caspase，导致 Caspase 级联放大，诱导宿主细胞发生凋亡[11-13]。而Caspase非依赖型线粒体通路由AIF和EndoG从线粒体释放和核易位引起，造成核 DNA 片段化等[14]。内质网通路 内质网通路属于内源性细胞凋亡通路。内质网不仅是合成蛋白质的工厂，也是 Ca2+的主要储存库。因此，内质网在维持细胞蛋白的合成、加工及 Ca2+离子的稳定中发挥举足轻重的作用。当机体细胞受营养不良和缺氧等外界刺激时，内质网腔内 Ca2+离子紊乱，错误折叠蛋白增多，通常引起内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress, ERS），内质网应激反应可以减少细胞中蛋白质的合成，增加蛋白正确的折叠并维持 Ca2+稳态。但过度的应激反应会使得 Ca2+大量释放到胞质，激活和转移依赖于 Ca2+的蛋白酶到内质网膜，进一步剪切活化起始 Caspase-12，活化的 Caspase-12 激活下游的执行 Caspase-3/7，触动细胞内的凋亡信号，促使细胞凋亡[15, 16]。三种凋亡途径在生物体中并非完全独立，而是形成以线粒体通路为主导，其余各通路之间相互联系，共同介导机体细胞凋亡。
图 1.2 IAP 介导 Caspase 参与细胞凋亡不同机制[75]a：IAPs 直接抑制 Caspase；b：泛素介导的 Caspase 调节。Fig 1.2 Different mechanisms of IAP-mediated Caspase involvement in apoptosis[75]a: IAPs directly inhibit Caspase; b: ubiquitin-mediated Caspase regulation..4 IAP 介导其他信号通路IAP 除了参与典型的细胞凋亡功能，在其他信号通路中也扮演重要角色受各种胞内应激（包括 DNA 损伤）激活转录因子 NF-κB 家族，根据 NF-κ活机制不同，分为 NF-κB 经典通路和非经典通路[76, 77]。这两种通路都是素的信号转导级联，，包括泛素连接酶、泛素受体和去泛素化酶的聚集、识除泛素信号，允许受控蛋白质复合物组装，调节 NF-κB 信号通路[78,79]。IA素连接酶活性的 RING 结构域，已成为 NF-κB 信号转导关键调控。昆虫 径与哺乳动物 TNF 介导信号转导途径有关，因为二者在结构上和功能上的成分[80]。黑腹果蝇 DIAP2 最早被证明调节 NF-κB 信号通路，DIAP2 K1-TAB2 或 TAB3 介导的激活 NF-κB 转录因子非常必要[81-83]。缺乏 DIAP
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S884.51;Q933
本文编号：2702710
【图文】：
成异源复合体，进一步招募起始 Caspase-9 前体，Caspase-9 通过自我剪切进行活化，活化后的起始 Caspase 进一步激活下游执行 Caspase，导致 Caspase 级联放大，诱导宿主细胞发生凋亡[11-13]。而Caspase非依赖型线粒体通路由AIF和EndoG从线粒体释放和核易位引起，造成核 DNA 片段化等[14]。内质网通路 内质网通路属于内源性细胞凋亡通路。内质网不仅是合成蛋白质的工厂，也是 Ca2+的主要储存库。因此，内质网在维持细胞蛋白的合成、加工及 Ca2+离子的稳定中发挥举足轻重的作用。当机体细胞受营养不良和缺氧等外界刺激时，内质网腔内 Ca2+离子紊乱，错误折叠蛋白增多，通常引起内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress, ERS），内质网应激反应可以减少细胞中蛋白质的合成，增加蛋白正确的折叠并维持 Ca2+稳态。但过度的应激反应会使得 Ca2+大量释放到胞质，激活和转移依赖于 Ca2+的蛋白酶到内质网膜，进一步剪切活化起始 Caspase-12，活化的 Caspase-12 激活下游的执行 Caspase-3/7，触动细胞内的凋亡信号，促使细胞凋亡[15, 16]。三种凋亡途径在生物体中并非完全独立，而是形成以线粒体通路为主导，其余各通路之间相互联系，共同介导机体细胞凋亡。
图 1.2 IAP 介导 Caspase 参与细胞凋亡不同机制[75]a：IAPs 直接抑制 Caspase；b：泛素介导的 Caspase 调节。Fig 1.2 Different mechanisms of IAP-mediated Caspase involvement in apoptosis[75]a: IAPs directly inhibit Caspase; b: ubiquitin-mediated Caspase regulation..4 IAP 介导其他信号通路IAP 除了参与典型的细胞凋亡功能，在其他信号通路中也扮演重要角色受各种胞内应激（包括 DNA 损伤）激活转录因子 NF-κB 家族，根据 NF-κ活机制不同，分为 NF-κB 经典通路和非经典通路[76, 77]。这两种通路都是素的信号转导级联，，包括泛素连接酶、泛素受体和去泛素化酶的聚集、识除泛素信号，允许受控蛋白质复合物组装，调节 NF-κB 信号通路[78,79]。IA素连接酶活性的 RING 结构域，已成为 NF-κB 信号转导关键调控。昆虫 径与哺乳动物 TNF 介导信号转导途径有关，因为二者在结构上和功能上的成分[80]。黑腹果蝇 DIAP2 最早被证明调节 NF-κB 信号通路，DIAP2 K1-TAB2 或 TAB3 介导的激活 NF-κB 转录因子非常必要[81-83]。缺乏 DIAP
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S884.51;Q933
【参考文献】
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1 彭黎明,江虹;细胞凋亡检测方法的研究进展[J];中华病理学杂志;2001年02期
本文编号：2702710
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