家蚕抗BmNPV抗菌肽的鉴定及抗性机制解析

发布时间：2020-06-08 23:14

【摘要】：家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,具有重要的经济和研究价值,与鳞翅目的其他成员一样,家蚕具有先天免疫系统,缺乏获得性免疫系统。每年蚕病给我国蚕桑产业造成了巨大的经济损失,其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的血液型脓病对养蚕业危害尤其严重,不仅降低了蚕丝的产量和质量,也不利于我国蚕桑产业的可持续发展。因此探究家蚕与BmNPV相互作用的分子机制,鉴定可与病毒相互作用的家蚕抗病毒蛋白,对该病的有效防控有重要作用。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是家蚕体内特异基因编码产生的一类有免疫效应的小分子多肽,其氨基酸残基数目小于100,是昆虫体液免疫中重要的抗菌因子,具有分子质量小、热稳定性强、抗菌谱广、无免疫原性、对高等动物正常细胞无毒等特点。已有研究表明家蚕抗菌肽具有广谱抗菌性,但是否具有抗BmNPV的能力未见报道,故本研究以鉴定家蚕抗菌肽抗BmNPV能力和探究其抗性机制为目的进行了相关研究,并获得以下研究成果:1.BmNPV病毒诱导上调表达的抗菌肽筛选本研究以家蚕BmNPV抗性品系871C为模型,通过转录组和蛋白组分析了在抗性品系中受BmNPV病毒感染上调表达的抗菌肽。其中转录组数据筛选出的抗菌肽基因有BmGloverin1(BmGlv1)、BmGloverin3(BmGlv3)、BmAttacin1(BmAtt1)、BmLebcin3(BmLeb3)、BmMoricin3(BmMor3)、BmCecropinB1(BmCecB1)、BmCecropinB2(BmCecB2)、BmCecropinB3(BmCecB3)和BmCecropinD1(BmCecD1);蛋白组数据筛选出的抗菌肽包括BmGlv1、BmGlv3、BmGlv4和BmCecD1。此外,通过蚕体水平和细胞水平进一步验证,结果显示:蚕体水平BmCecB2、BmCecD1、BmGlv3和BmLeb3的表达量在感染BmNPV后显著上调;细胞水平BmCecB1、BmCecB2、BmCecD1、BmGlv3和BmLeb3的表达量在感染BmNPV后显著上调。综合转录组数据、蛋白组数据以及蚕体和细胞水平验证结果,最终筛选出可能参与抗病毒通路的抗菌肽为BmCecB2、BmCecD1、BmGlv3和BmLeb3。2.抗菌肽抗BmNPV病毒能力的鉴定为了鉴定所筛选抗菌肽的抗BmNPV能力,首先对筛选出来的四个抗菌肽进行生物信息学分析,发现四个抗菌肽均具有信号肽,不具有核定位信号。其次构建了四个抗菌肽的过表达载体pIZ/V5-His-BmGlv3、pIZ/V5-His-BmLeb3、pIZ/V5-His-BmCecB2和pIZ/V5-His-BmCecD1。在细胞水平过表达抗菌肽,TCID50、实时荧光定量PCR、流式细胞术检测过表达抗菌肽对病毒复制增殖的影响,结果显示与对照组相比,四个抗菌肽分子均降低了病毒感染率,但其降低程度有所差异,病毒增殖情况从强到弱排序为:空白对照组pIZ-BmLeb3组pIZ-BmCecB2组pIZ-BmGlv3组pIZ-BmCecD1组。本研究进一步鉴定了抗菌肽分子之间的剂量效应,与单独过表达BmCecB2或BmGlv3组相比,共同过表达BmLeb3与BmCecB2、BmLeb3与BmGlv3实验组增强了其抗病毒能力,表明了抗菌肽之间能够协同增强抗病毒能力。为了鉴定抗菌肽在蚕体上的抗病毒能力,本研究利用杆状病毒表达系统在蚕体上过表达四个抗菌肽基因。结果显示,与细胞水平结果一致,过表达四个抗菌肽均抑制了BmNPV的增殖,BmCecD1抗BmNPV能力最强,而BmLeb3抗BmNPV能力最弱;与细胞水平结果不同的是,在蚕体上BmCecD1表现出与其他抗菌肽协同增强抗病毒的能力。进一步统计实验组和对照组病蚕死亡情况发现,抗菌肽的过表达显著延迟了BmNPV感染后的幼虫死亡时间。3.抗菌肽抗病毒机制初探综合细胞和个体上抗菌肽抗病毒能力,选取代表不同类型且抗病毒能力最强的抗菌肽亚家族的抗菌肽BmCECD1和BmGLV3用于解析其抗病毒机制。本研究通过免疫荧光技术鉴定了抗菌肽BmCECD1和BmGLV3感染病毒前后的亚细胞定位特征。结果发现,病毒感染后0~48 h两个抗菌肽均定位于细胞质中,感染后72 h时皆有部分进入了细胞核中,感染后96 h时BmCECD1完全进入了核内,而BmGLV3只有一部分进入了核内,一部分仍然在细胞质中。因为抗菌肽不存在核定位信号,我们推测BmCECD1和BmGLV3的入核现象与其抗BmNPV机制有关。实时荧光定量PCR检测不同时间点的BmCecD1和BmGlv3抗BmNPV情况发现,从感染后48 h开始BmCecD1和BmGlv3均表现出了一定的抗病毒能力,在感染后72~96 h,实验组中的病毒增殖被显著抑制,且BmCecD1到感染晚期抑制病毒基因复制能力增强。为了进一步探究抗菌肽抗病毒机制,以BmCECD1和BmGLV3为诱饵蛋白通过免疫共沉淀和质谱分析,钓取了与其相互作用的蛋白。通过免疫荧光发现BmNPV IE1与BmCECD1共定位于细胞核中,BmNPV DBP与BmGLV3共定位于细胞质中,且免疫共沉淀实验再次验证了BmNPV IE1与BmCECD1、BmNPV DBP与BmGLV3具有相互作用。结合BmNPV IE1蛋白和BmNPV DBP蛋白相关研究结果推测,BmCECD1可能通过和BmNPV IE1相互作用,抑制了病毒DNA复制,从而抑制病毒的增殖;BmGLV3可能通过与BmNPV DBP相互作用,抑制了病毒核衣壳及病毒发生基质的产生,从而抑制了病毒的增殖。
【图文】：

图 1.1 昆虫中的免疫信号通路[16]和革兰氏阳性细菌激活，并且 Imd 途径被革兰氏阴性细菌激活。这两种信号传导途的蛋白质转移到细胞核中导致抗菌肽的诱导。Figure 1.1 Immune signaling pathways in insects. activated by fungi and Gram-positive bacteria, and Imd pathway is activated by Gram

图 1.2 抗菌肽作用模式模型的示意图[67]。子微生物表面的静电吸引，（B）穿过外膜和/或肽聚糖层的通过，（C）对细胞质膜中阴）结构化，膜插入和积累，，（E）环形孔形成，（F）用于膜透化的地毯机制，（G）桶效应（DNA/蛋白质结合，膜组成重排，对基本细胞机器的干扰等）。 1.2 Schematic representation of the proposed models for the mode of action
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S881

【参考文献】

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本文编号：2703794