水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答机制的定量蛋白质组学研究

发布时间：2020-06-15 22:51

【摘要】：水稻是世界上最重要的粮食作物之一,它广泛的适应性和高产性能使水稻生产具有巨大社会意义和重要的战略意义,在粮食危机愈演愈烈和人口总数不断增长的历史背景下,全世界对水稻生产的期望也越来越高。据预测,到2050年,水稻产量在现有基础上翻一番才能基本满足不断增长人口需求。水稻病害是造成稻谷产量下降的主要原因之一,如水稻三大病害之一的稻瘟病每年给水稻造成11-30%的产量损失。尽管化学防治对水稻病害效果显著,但由于施用时期局限、病原菌抗药性增强、对环境造成严重污染和对稻米品质的关注提高,一定程度上限制了化学药剂的使用。与之相反,抗病水稻品种的选育及大面积推广却是多年来被证明为防治病害最经济、最有效和最安全的解决途径。本论文研究内容涉及植物生理学、生物化学、定量蛋白值组学等技术,研究内容主要包括(1)通过体外标记技术(iTRAQ)结合高通量的质谱鉴定平台(LC-MS/MS),对水稻响应稻瘟菌侵染胁迫时,不同时间段叶片样本蛋白质表达进行研究;(2)对不同抗性水稻品种响应稻瘟菌侵染胁迫时叶片样本蛋白质表达进行定量研究;(3)通过生物信息学手段结合实验验证,旨在找到稻瘟菌侵染水稻时,水稻发生差异表达的蛋白,从而从分子水平阐明抗病性机制,为培育优质、抗病的水稻新品种奠定基础,推动水稻抗稻瘟菌的分子机制研究。本论文的主要结果是:1)在水稻对稻瘟菌侵染不同时间胁迫应答的定量蛋白质组学研究中,我们提取谷梅2号在稻瘟菌(Guy11)侵染0小时、24小时、48小时后的叶片蛋白,进行定量、酶解及标记处理,再根据肽段特征,将复杂肽段进行SCX柱的初级分离,最后通过LC-MS/MS高通量质谱鉴定平台(ABSECXTripleTOFTM4600)进行图谱采集。通过ProteinPilot4.5软件(ABSCIEX,FosterCity)针对280,528条Oryzasativa蛋白序列进行搜索。数据采集时,对每个组分进行两次技术重复,即共采集20个组分,每10个组分采集图谱经过软件整合到一个文件中,每个文件分别针对Oryzasativa库进行比对搜索,两次结果表为Repeat 1 和 Repeat2。结果显示,Repeat 1 在 FDR 为 1.0%时,共鉴定到 33,373 Spectral,15,835条肽,1,604 个蛋白。Repeat2 在 FDR 为 1.0%时,共鉴定到 33,004 Spectral,15,800条肽,1,581个蛋白。取2个及2个以上肽段支持的蛋白作为分析的结果。结果表明,Repeat1共有1,234个蛋白,Repeat2共有1,210个蛋白。根据上述得到的结果,将两次实验得到的蛋白进行分类,分为上调和下调,将ratio值大于1.2的标为上调,小于0.8的标为下调,去除只有一次鉴定到的且趋势不一致的蛋白,剩余蛋白分为五组:在稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量在两个时间段都上调的一组共121个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量有一时间段上调的一组共26个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量有一时间段下调的一组共34个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量有一时间段上调且另一时间段下调的一组共43个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量两个时间段都下调的一组共148个蛋白。对差异表达蛋白进行生物信息学分析、GO分类和KEGG-pathway分析,结果表明,这些差异表达蛋白共在79个通路中起着关键作用,参与较多的为光合作用途径;对差异表达蛋白进行分泌蛋白分析,发现其中61个蛋白具有信号肽,可能为分泌蛋白。进行GO enrichment分析时,发现在TCA循环、NADP代谢过程、异构酶活性等15个分类中有富集;我们还将这些蛋白进行网络互作分析,通过string在线分析发现,有314个功能被String数据库收录,分析显示,这314个蛋白存在相互作用,有两类蛋白发生聚类现象,对这些蛋白进行分析发现这两类蛋白分别为:一类为光合相关蛋白,另一类为核糖体相关蛋白。这两类蛋白在水稻中起着重要功能,光合相关蛋白参与光合作用,提供能量;核糖体蛋白与转录调控有关。提示在稻瘟菌侵染水稻时,这两类蛋白发生了变化,参与了水稻拮抗稻瘟菌的过程。在水稻受稻瘟菌侵染不同时间段表达差异的蛋白中,发现胰蛋白酶抑制剂含量显著上升。定量PCR分析结果表明,编码胰蛋白酶抑制剂基因在mRNA水平也显著上升。胰蛋白酶抑制剂是一类能够抑制蛋白水解酶活性的蛋白质,该蛋白能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。因此它具有防止体内不必要的蛋白降解,调节蛋白代谢及调节各种蛋白酶生理活性的功能。很多植物的胰蛋白酶抑制剂还具有抑制某些病原微生物及某些昆虫体内蛋白酶的作用,是植物体的一种自然防御体。有趣的是我们在筛选差异表达蛋白质时,发现一个putative dioscorin的蛋白,dioscorin为山药储藏蛋白。有研究表明,该蛋白有胰蛋白酶抑制剂活性,在我们鉴定的结果中也显示该蛋白在水稻遭受稻瘟菌侵染时,表达量显著提升,与胰蛋白酶抑制剂的趋势是一致的。研究还表明,与光合作用密切相关的蛋白,如Rubisco的大亚基、Rubisco subunit binding-protein alpha subunit等,在水稻遭受稻瘟菌侵染时表达量急剧下降,而与能量代谢相关的蛋白,如 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain,则在水稻遭受稻瘟菌侵染时表达量上调。2)在不同抗性水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答的定量蛋白质组学研究中,我们对提取的稻瘟菌(Guy11)侵染24小时的抗稻瘟菌水稻(谷梅2号)和不抗稻瘟菌水稻(黑谷)的叶片蛋白进行定量、酶解及标记处理,再根据肽段特征,将复杂肽段进行SCX柱的初级分离,最后通过LC-MS/MS高通量质谱鉴定平台(ABSECXTripleTOFTM4600)进行图谱采集。通过 ProteinPilot4.5 软件(ABSCIEX,FosterCity)针对 Oryzasativa 蛋白序列进行搜索。在FDR为1.0%时,取2个及2个以上肽段支持的蛋白进行分析。两次重复分别鉴定到1,196和1,180个蛋白。将ratio值大于1.2的标为上调,小于0.8的标为下调,去除只有一次鉴定到的且趋势不一致的蛋白,在抗性水稻种得到上调表达的蛋白220个,下调表达的蛋白240个。对差异表达蛋白进行生物信息学分析、GO分类和KEGG-pathway分析,结果表明,这些差异表达蛋白共在81个通路中起着关键作用,参与较多的为糖异生/糖酵解途径。进一步将差异表达蛋白进行分泌蛋白分析,发现其中68个蛋白具有信号肽,可能为分泌蛋白。进行GO enrichment分析时,发现在光合作用、羧酸代谢过程,叶绿体组成等11个分类中有富集;我们还将这些蛋白进行网络互作分析,通过string在线分析发现,有385个功能被String数据库收录,这385个蛋白存在相互作用,有两类蛋白发生聚类现象,对这些蛋白进行分析发现这两类蛋白分别为:一类为能量代谢相关蛋白,另一类为核糖体相关蛋白。这与前面GO enrichment分析的结果是一致的,不同抗性的水稻在能量代谢和转录合成存在差异,深入研究这些差异功能,为阐明水稻抗稻瘟菌的分子机制做出贡献。在研究内容1)中我们发现,抗稻瘟菌谷梅2号在遭受稻瘟菌侵染时,胰蛋白酶抑制剂的表达显著提升,在质谱分析结果和定量PCR结果一致。在不同抗性水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答机制研究中,我们发现抗稻瘟菌株水稻在遭遇稻瘟菌侵染时,胰蛋白酶抑制剂的表达量比不抗稻瘟菌株(黑谷)显著提升,这一结果与Peng等在番茄叶片遭受致病疫霉时结果是一致的。根据本研究的结果,我们认为稻瘟菌在侵染水稻时,可能需要大量水解蛋白以提供能量,水稻为了拮抗稻瘟菌的侵入,高表达胰蛋白酶抑制剂,从而抑制胰蛋白酶的活性,而具有胰蛋白酶抑制剂活性dioscorin(山药储藏蛋白)也急剧提升,从而达到抑制胰蛋白酶的活性,最终达到拮抗稻瘟菌的侵染。光合代谢相关的蛋白 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit表达在抗稻瘟菌株中比感染株中显著下调,且两个蛋白在抗稻瘟菌株中比感染株中显著下调;由此,我们推测,稻瘟菌侵染水稻,抗稻瘟菌株水稻通过下调表达 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit,从而降低抗稻瘟菌水稻叶片的光合作用,拮抗稻瘟菌的侵入。能量代谢相关蛋白 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain 在不同抗性水稻遭遇稻瘟菌侵染下,ATP synthase CFI beta subunit有限上调,而ATP synthase CF1 alpha chain基本没有变化。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.111.41
【图文】：

示意图,信号转导途径,水杨酸,论文

ＳＡＢＰｓ”复合体，接着将信息传递给胞内第二信使如比０２等，信号会通过自我反馈机制放逡逑大，在细胞内转导引发超敏反应（ＨＲ），同时引起胞内氧化还原状态改变，激活相关转录逡逑因子的活化与互作，最终诱导ＰＲ基因表达及系统获得性抗性的产生（图１．２）。逡逑逦逦邋ＳＡＷ＊逡逑Ｈ；Ｏｊ邋Ｈｉ0＞邋Ｗ逡逑，逦￥ａｂ！＾逦Ｉ逡逑７逦灥：抗试ｖ＇老＇逡逑Ｉ逦ＨＳｖＪＭｋ／ＳＨ逦ＨＳ邋／邋ＳＨ逡逑ｍ邋ｈｖＷｓｈ邋yU逡逑：？＇廔，３＾逡逑１邋ＰＯ邋ｃｉｃｍｃｎＴＴ邋｛邋ｉ？－ｉ邋｜逦｜邋Ｗ邋ｂｏｘ邋｜逦［逦＾邋ＰＢ邋ｅｌｅｍｅｎｔ邋｜逦１邋ａｓ－ｉ邋＼逦｜邋Ｗ－ｂｏｘ邋１逦１逦＼逡逑￣：＝－＾ｘ邋＾邋—邋－１—逡逑ｌ逦，＿＿＿．逡逑、＾邋［邋ＰＢ邋ｅｌｅｒｗＣＴｔ邋｜邋［邋ａ＾ｌ邋１逦［邋Ｗ－ｂｏｘ邋１邋１逦｜逡逑图１．２水杨酸信号转导途径示意图，图片引自周莹等的论文（周莹ｅｔａｌ．，２００７）。逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＳＡ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｐａｔｈｗａｙ（周堂邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）．逡逑９逡逑

示意图,离子化,示意图

技术的第一步。质谱技术中常应用到的电离方式有：电喷雾离子源（ＥＳＩ）、大气压化学电逡逑离源（ＡＰＣＩ）、基质辅助激光解析电离（ＭＡＬＤＩ）和大气压光电离源（ＡＰＰＩ）。检测生物逡逑大分子的生物质谱，主要应用到ＥＳＩ和ＭＡＬＤＩ离子源软电离技术（图１．３）。电喷雾离子逡逑源（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ邋Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＥＳＩ）与液相色谱联用（Ｐａｉｋｅｔａｌ．，邋２０１２），液体在色谱分离后经逡逑喷针喷出处施加高电压，产生高电场，辅助氮气，使流出的液体雾化成细小的带电液滴，逡逑细小液滴进一步去溶剂后实现离子化，形成大量带一个电荷或多个电荷的离子，即库伦爆逡逑炸，使分析物以气相形式进入质量检测器。由于ＥＳＩ源产生的为多电荷离子，使质荷比降逡逑低，大大扩展了生物大分子的检测范围；基质辅助激光解吸电离（Ｍａｔｒｉｘ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ邋Ｌａｓｅｒ逡逑Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，邋ＭＡＬＤＩ）邋（Ｍａｒｇｕｅｒａｔｅｔａｌ．，２０１２）技术是将待测样品与基质混合，样逡逑品均匀的分散在基质中并形成结晶，激光作用于混合有样品的晶体，化学基质吸收光子被逡逑激活

【参考文献】