烟草赤星病生防菌筛选及发酵条件优化

发布时间：2020-06-19 21:50

【摘要】：赤星病是烟草上的主要病害之一,每年给我国烟草生产造成巨大的经济损失。目前,可用于赤星病防治的方法较多,其中最具有应用前景与发展潜力的当属生物防治。烟草根际土壤和烟叶叶围等处包含有大量的微生物资源,其中部分微生物因其具有可以抑制病原微生物、促进烟草生长和诱导系统获得性抗性的表达等特性,所以在生产上被广泛应用于病虫害的生物防治。本文从烟草根际土壤中分离出82株细菌,通过平板对峙法初步筛选和双层平板法复筛,筛选出对烟草赤星病菌有较强拮抗作用的细菌F11菌株,其无菌发酵液对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的抑菌带达到23.5 mm。对F11菌株进生理生化和分子鉴定,结果表明F11菌株生理生化特征与Bacillus methylotrophicus最为接近,其16S r RNA基因序列与芽孢杆菌属(Bacillus)有99%的同源性。加测F11菌株的gyr A基因,发现F11的gyr A基因序列与甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus Y37菌株的gyr A基因序列同源性达99%。鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)。从5种常用细菌培养基中筛选最佳培养基。使用Design-Expert软件,采用响应面法寻找最优发酵条件。最佳培养基为PDB,最佳培养条件为:培养温度35℃、初始p H 7.5、接种量3%、发酵时间36 h、摇床转速160 r/min、瓶装量100m L/250m L。在此优化条件下,发酵液抑菌带可达26.8 mm,比优化前(20.3mm)提高了32%。此菌株抑菌活性强,具有开发成生防剂的潜力;为烟草赤星病的防治机理的研究提供一定的参考依据。通过生防菌的生防机制初步研究表明:(1)F11菌株发酵上清液对烟草赤星病菌丝形态有明显的影响作用,主要表现出顶端膨大、菌丝畸形成结节状,原生质明显聚集,菌丝呈念珠状膨大,细胞破裂,细胞质外渗。(2)不同浓度F11发酵上清液均能抑制赤星病菌孢子的萌发,不同时间的抑制率均随着发酵上清液浓度的增加而增加。经不同浓度处理的赤星病孢子表现为大部分液泡化并破裂,细胞质外渗,畸形萌发,且萌发部位出现膨大、圆泡状物等现象,不能发育成正常菌丝。(3)用F11菌株发酵上清液处理菌丝后,菌丝内电解质渗漏发生严重,处理的电导率均高于对照。(4)经F11菌株发酵上清液处理的烟草赤星病菌菌丝体内的内含物(可溶性糖和可溶性蛋白)大量外渗,总糖和可溶性蛋白质含量均低于对照组,会导致菌丝体内自身总糖和可溶性蛋白含量减少。(5)烟草赤星病菌菌丝体在经F11发酵上清液处理后,其苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性均会降低,导致菌丝体细胞生长缓慢或停滞。在前期研究基础上,选用10%苯醚甲环唑、40%菌核净、10%多抗霉素,以及F11菌株发酵上清液和F11菌株活菌液进行田间防效试验。结果表明:3种药剂处理和2种菌剂对烟草赤星病均有一定的防治作用。其中防效最好的是10%多抗霉素,相对防效为63.14%;其次是40%菌核净,相对防效为58.71%;10%苯醚甲环唑的相对防效为49.71%;F11菌株发酵上清液和活菌液也有一定的作用,防效分别为41.43%和49.86%。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476;S435.72
【图文】：

烟草赤星病,生防菌

到碳源基础培养基20 mL中后灭菌。取10 uL浓度为108cfu/mL的F1培养基内试管内，于35℃下振荡(150 rpm)培养，以不接菌的培养察并在625 nm处测定菌体的吸光度并记录结果。氮源对 F11 生长的影响源种类为蛋白胨、草酸铵、牛肉膏、酵母浸膏和尿素等，以 1%的源基础培养基 20 mL 中后灭菌。取 10 uL 浓度为 108cfu/mL 的 F1培养基内，于 35℃下振荡(150 rpm)培养，以不接菌的培养基为并在 625 nm 处测定菌体的吸光度并记录结果。与分析防菌的筛选过平板对峙法初步筛选出 4 株对烟草赤星病菌生长有抑制作用的见图 1.1)，再用双层平板法进行复筛，比较 4 株菌株对病原菌生长菌效果见图 1.2)。

烟草赤星病,生防菌,复筛,抑菌效果

图 1.2 烟草赤星病生防菌复筛结果Fig. 1.2 The results of screening of tobacco brown spot disease-resistant bacteria表 1-1 表明，经复筛，4 株菌株对病原菌生长均有明显的抑制作用，其中菌株的抑菌活性最强。对病原菌的抑菌带为 23.5 mm，4 株生防菌的抑菌效果实验对照组差异性显著，其中 F11 抑菌效果差异显著型最强。表 1-1 4 株生防菌对烟草赤星病原菌的抑制效果及抑菌效果差异显著性分析Table 1-1 Inhibitory effect of four antagonistic bacteria on Alternaria alternata and significant differeanalysis of antibacterial effect菌株编号Strain number抑菌带Inhibition zone (mm)① ② ③ 平均F11 23.5 23.8 23.2 23.B2 16.5 16.0 14.6 15.F10 14.9 15.0 15.0 15.

【参考文献】