辽冀鲁花生疮痂病菌遗传多样性及遗传结构研究

发布时间：2020-06-19 23:42

【摘要】：花生疮痂病菌由落花生痂圆孢菌(Elsino?arachidis BitaucourtetJenkins)引起,是我国花生生产上的主要病害之一。该病常造成叶片皱缩,叶柄及茎部扭曲,减弱植株长势引起减产,一般病田减产10%-30%,严重时损失可达50%以上,严重制约了花生产业的发展。该病害自上世纪90年代初在广东暴发成灾后,相继在广西、福建、江苏、山东、河北等主要花生产区发生流行,2010年在辽宁省兴城首先发现,2011年辽宁阜新、锦州及葫芦岛等花生主产区大面积流行成灾,经济损失严重。花生疮痂病研究基础相对较为薄弱,对于病害的发生流行规律、病菌的传播动态、群体遗传多样性和遗传结构等尚未见相关研究报道。本文以分离自辽宁、河北和山东花生主产区的疮痂病菌为研究对象,系统开展了病原菌ISSR反应体系建立、培养性状和遗传多样性等研究工作,并通过遗传结构、遗传分化及发生时间历程比较,初步分析了三个地区间的菌源关系,研究结果对于花生疮痂病菌的传播规律、流行动态及病原菌迁移等研究提供了理论研究基础。主要研究结果如下:1.花生疮痂病菌分离鉴定与培养性状研究采集来自辽宁、河北、山东、江苏、福建和广西六省的花生疮痂病标本3000余份,采用优化的组织分离技术得到519株花生疮痂病菌菌株,本试验重点研究辽冀鲁三省的375株,并结合培养性状、形态特征和分子序列分析鉴定分离菌株均为花生疮痂病菌。供试菌株具丰富的形态多样性,病原菌生长缓慢,生长速度、形态、颜色及质地差异显著。在PDA培养基上培养30d时菌落直径0.67-3.76cm,平均2.55cm(n=375)。菌落颜色分别有白色、黄白色、橙黄色、红棕色、红色等多种颜色,光照条件菌落周围红色或红棕色晕圈明显。菌落多为质地柔软、光滑、覆有绒毛状气生菌丝,且菌落形态多变不规则,中央隆起,边缘呈波浪状,少量呈圆形。2.花生疮痂病菌ISSR-PCR反应体系的建立与优化使用五因素四水平的正交设计与细调性单因素试验对花生疮痂病菌PCR反应主要成分的用量进行系统研究,建立并优化了最优ISSR-PCR反应体系。25μL的反应体系中包括Mg~(2+)2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物0.88μmol/L,模板DNA30-40ng;筛选出的8条最适ISSR引物及退火温度为UBC809(52.7℃)、UBC810(50.8℃)、UBC812(55.6℃)、UBC834(52.7℃)、UBC842(55.6℃)、UBC844(52.7℃)、UBC880(52.7℃)、UBC881(50.4℃);PCR反应程序为:94℃预变性4 min,94℃变性1 min,退火1 min,72℃延伸1 min,35次循环,72℃延伸10 min,4℃保存。该体系经检验的稳定可靠,适用于花生疮痂病菌的遗传多样性分析,为系统进行花生疮痂病菌群体遗传研究奠定了基础。3.辽冀鲁花生疮痂病菌遗传多样性研究采用优化的ISSR-PCR反应体系对辽宁(184株)、河北(135株)和山东(56株)花生疮痂病菌进行了遗传多样性研究,结果显示辽宁省花生疮痂病菌有较高的遗传多样性和中等遗传分化,亚群体之间差异明显,多态性位点比率为34.62%-75.64%,Nei’s遗传多样性指数和Shannon信息指数范围分别为0.14-0.25和0.20-0.37,亚群间遗传分化系数θ范围为0.087-0.347,呈中等遗传分化。河北省和山东省的花生疮痂病菌遗有分化程度较低,多态性位点比率分别为83.33%和66.67%,Nei’s遗传多样性指数均为0.21,Shannon信息指数分别为0.33和0.32,遗传分化系数θ分别为0.025和0.061,基因流分别为20.39和10.35,均表明河北和山东群体遗传分化不明显。4.辽冀鲁花生疮痂病菌群体遗传结构比较及菌源关系分析通过比较辽冀鲁三省花生疮痂病菌群体间遗传结构以及发生时间历程,初步分析三省间种群菌源关系。群体间基因流和两两间比较分析显示,群体间的基因流Nm均大于4(5.032-10.010),说明基因交流频繁。AMOVA分析表明三省群体间存在一定的遗传分化,但82%的变异来自亚群体内,10%的变异来自亚群体间,仅有8%的变异来自群体间。PCA主成分分析表明,三省菌株群体间交叉并存,山东省群体分布最集中,辽宁群体最分散,且山东与辽宁群体交叉重叠区域最大。Structure分析显示三省群体可分为四个遗传组,各组的比例在三省群体中分布不同,其中三个遗传组为三省群体共享,一种为辽宁省独有。三省病害发生历程为山东2001年发生,河北2004-2010年逐渐加重,辽宁2010年于兴城发生后,2011年起大范围流行,表明了病原菌从山东到河北和辽宁的传播方向。结合遗传结构和发生时间历程可初步推断三省病菌的菌源关系为:辽宁省群体可能部分来源于山东省和河北省群体,河北省群体可能部分来源于山东的群体。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.652
【图文】：

漂变,种群,频率,基因流

图 1-1. 漂变对不同大小种群中基因频率的影响（Marginalia, 2009）Fig. 1-1. Effect of genetic drift on allele frequency of variable population size (Marginalia, 2009)在农业生态系统中，寄主植物的遗传一致性往往使得植物病原真菌的群体很大，因此在某块田间，遗传漂变对病原菌演化力的影响可能微乎其微。但因农业生态系统中的奠基者效应的存在，我们不能忽略遗传漂变的作用。在自然生态系统中，寄主植物不均匀的分布使得其病原真菌群体很小，这种情况下，遗传漂变的作用就会十分明显。2.2.3 基因流基因流（Gene flow）是特定等位基因或个体在不同地源种群间的交换过程。有些真菌只能通过无性繁殖方式来产生后代，在种群间的交换中不能进行基因重组，交换的是整个基因型，这种交换的过程则称作基因型流（Genotype flow）。基因流产生的条件有二：该物种至少存在一个以上的种群或亚群；不同的种群或亚群间的个体可自由移动(祝雯与詹家绥, 2012)。通过基因流，毒性突变基因和基因型可在不同地域的种群间进行交换。较高的基因可以通过提高在遗传上相邻种群的大小来扩大种群大小，因此具有高基因的种群往往会表现出较高水平的遗传多样性。锈菌和白粉菌产生的大量孢子可随风进行可达数千公里

传播路线,锈菌,北美

锈菌传播路线 (Mcdonald and pathway in North America (Mcd在种群内的个体间的如何分菌的生殖方式包括无性生减数分裂时进行基因的重组生或组合新的毒性基因或抗绥, 2012)。而无性繁殖是许，无性孢子是致使病害流行性生殖阶段，但其群体变异此基因型多样性对其群体遗可使其发生遗传重组，对群

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