桑叶经霜前后绿原酸生物合成途径差异表达基因分析及关键酶基因功能验证

发布时间：2020-07-09 16:28

【摘要】：桑叶为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶,是我国传统中药之一,味甘、苦,性寒,归肝、肺经,具有疏散风热,清肺润燥,清肝明目的功效。桑叶药用历史悠久,历来有经霜采收的要求,且中医认为霜桑叶品质上乘,但现有结果对桑叶经霜采收的科学内涵尚未完全阐明。课题组前期对桑叶经霜前后主要活性成分的动态变化进行了研究,发现经霜后绿原酸和黄酮醇苷类成分含量升高,已经初步探究了经霜对黄酮醇苷类成分影响的分子机制,但尚未对经霜前后绿原酸成分差异的分子机制进行研究。本论文采用高效液相色谱法研究桑叶不同生长期绿原酸含量动态变化规律,选择绿原酸含量差异显著的样本进行转录组测序,利用比较转录组学技术筛选差异表达基因,分析差异基因表达水平与绿原酸含量的相关性,挖掘与绿原酸生物合成相关的关键酶基因,并对其进行克隆及功能分析,为阐明经霜前后绿原酸含量差异的分子机制奠定基础,同时也为研究桑叶绿原酸生物合成途径提供依据。主要研究内容如下:1.桑叶经霜前后绿原酸含量动态变化研究采用高效液相色谱法对桑叶经霜前后绿原酸含量动态变化进行研究,结果表明,绿原酸含量在7、8月份较低,霜降(10月23日)后含量逐渐升高于11月份达到最大值。绿原酸含量在7月31日为1.35?0.16 mg/g,11月15日达2.43?0.08 mg/g,两个样本中的绿原酸含量呈显著性差异(P0.01),该结果为转录组测序桑叶样本的选择提供了依据。2.桑叶经霜前后绿原酸生物合成途径差异表达基因研究采用Illumina HiSeq 2500测序平台对桑叶绿原酸含量差异显著(经霜前和经霜后)的样本进行转录组测序,通过转录组注释结果,并结合KEGG代谢通路分析,共有58条基因与绿原酸的生物合成相关,编码5种酶,分别为苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、4-香豆酸CoA连接酶(4-Coumarate-CoA ligase,4CL)、肉桂酸4-羟化酶(Cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)、莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)和香豆酸-3'-羟化酶(Coumaroyl ester 3'-hydroxylase,C3'H)。其中17条为差异表达基因,包括12条上调表达基因,5条下调表达基因。分析不同生长期差异基因表达水平与绿原酸含量的相关性,结果表明c34446_g1、c82179_g1、c46108_g1和c31168_g1基因表达水平与绿原酸含量变化呈显著正相关,这4条基因分别编码PAL、4CL、HCT和C3'H。推测这4条基因为绿原酸生物合成途径的关键酶基因,经霜后气候温度的下降可能诱导c34446_g1、c82179_g1、c46108_g1和c31168_g1基因的表达,有利于绿原酸的积累。3.桑叶莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶基因克隆、表达及功能分析从桑叶中克隆得到MaHCT(c46108_g1)基因,GenBank登录号为MH476577。MaHCT基因的开放阅读框长度为1320 bp,编码439个氨基酸。序列同源性分析表明MaHCT蛋白包含酰基转移酶家族的保守域HXXXD和DFGWG。构建了重组质粒pET-30a(+)/MaHCT,并在大肠杆菌中诱导表达获得重组蛋白,重组蛋白为部分可溶性蛋白,分子量约为53 kDa。对MaHCT蛋白进行性质表征,结果表明反应条件为37℃、pH=7.4时MaHCT酶活力最大;温度为4℃和25℃时,酶活性残留大于85%;pH值在6.4-7.4之间时,酶活性残留大于89%;Fe~(3+)和Zn~(2+)对酶活力起抑制作用,而Cu~(2+)对酶活力具有增强作用。体外酶促反应结果表明,MaHCT蛋白能有效地催化生成对香豆酰莽草酸、对香豆酰奎宁酸和绿原酸。酶动力学常数结果表明,当对香豆酰CoA作为酰基供体时,MaHCT对奎宁酸的亲和力高于莽草酸,并且对奎宁酸的催化效率高于莽草酸。当奎宁酸作为酰基受体时,MaHCT对对香豆酰CoA的亲和力高于咖啡酰CoA,并且对对香豆酰CoA的催化效率约为咖啡酰CoA的32倍。推测MaHCT更倾向于以对香豆酰CoA为酰基供体,奎宁酸为酰基受体,生成对香豆酰奎宁酸。4.桑叶香豆酸-3'-羟化酶基因克隆、表达及功能分析从桑叶中克隆得到MaC3'H(c31168_g1)基因,GenBank登录号为MK738016。MaC3'H基因的开放阅读框长度为1530bp,编码509个氨基酸。序列同源性分析表明MaC3'H蛋白属于p450 super family,包含4个CYP保守结构域:富含脯氨酸的膜铰链PPGP、I螺旋参与氧结合和激活GGXDTT、PERF和半胱氨酸结构域PFGAGRRXCP。构建了重组质粒pET-28a(+)/MaC3'H,并在大肠杆菌中诱导表达获得重组蛋白,最佳诱导条件:IPTG浓度为1 mmol/L,诱导温度为30℃,诱导时间6 h。重组蛋白为包涵体蛋白,分子量约为58 kDa,进行变性复性后获得可溶的MaC3'H蛋白。体外酶促反应结果表明,MaC3'H蛋白能有效地催化对香豆酰莽草酸、对香豆酰奎宁酸与NADPH生成咖啡酰莽草酸和绿原酸,表明MaC3'H具有3'位羟基化作用。但MaHCT不能催化咖啡酰莽草酸生成咖啡酰CoA。因此初步推测了桑叶中绿原酸可能的主要生物合成途径。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S888.2
【图文】：

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江苏大学硕士学位论文2.2.3”项下色谱条件对桑叶样品和绿原酸对照品进行分析，结果如图 2到较好的分离，且峰形良好。绿原酸标准曲线如图2.2所示，结果表明在32围内成良好的线性关系，回归方程为 y=12.149x-49.357（R2=0.9993）。

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23按“2.2.3”项下色谱条件对桑叶样品和绿原酸对照品进行分析，结果如图 2.1 所示。绿原酸得到较好的分离，且峰形良好。绿原酸标准曲线如图2.2所示，结果表明在32.19~1030μg/mL 范围内成良好的线性关系，回归方程为 y=12.149x-49.357（R2=0.9993）。图 2.1 绿原酸高效液相色谱图A: 绿原酸对照品; B: 桑叶样品Figure 2.1 High performance liquid chromatogram of chlorogenic acid.A. Chlorogenic acid references substances; B. Mulberry leaves sample

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0.79 0.66 1.43 95.79 0.77 0.66 1.42 98.83 0.75 0.83 1.55 96.82 97.87 0.76 0.83 1.57 97.43 0.78 1.00 1.77 99.94 0.77 1.00 1.75 98.39叶经霜前后绿原酸含量动态变化2016 年 5 月 5 日至 11 月 25 日桑叶中绿原酸含量进行测定，结果如图 2.35 月份气温较低时含量较高，之后随气温升高含量下降，7、8 月份较低， 23 日）后绿原酸含量逐渐升高达最大值随后缓慢下降。这与 Yan、张魏婉琪一致。7 月 31 日绿原酸含量为 1.35 0.16 mg/g，11 月 15 日达 2.43 0.之间绿原酸含量存在显著性差异（P<0.01）。

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