黄瓜花叶病毒外壳蛋白负调控病毒茎尖侵染的分子机制
发布时间：2020-07-09 22:32
【摘要】：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)在全球范围内分布广泛,能够在作物、观赏植物、蔬菜等单子叶或双子叶植物上引起严重的病害。CMV编码的外壳蛋白(coat protein,CP)以及沉默抑制子2b都是多功能蛋白,主要参与病毒运动和症状决定等致病过程。本研究前期实验发现,野生型CMV(CMVWT)在侵染初期进入寄主顶端分生组织,在侵染后期逐渐在茎尖消失,随后新生叶片出现“症状恢复”的现象。然而,突变体病毒CMVRA(CP的N端R13RRRPRR19突变为连续的A)会持续地侵入茎尖并在顶端组织中积累较高的水平,导致寄主顶端优势的丧失。在寄主顶端组织中,CMVWT比CMVRA诱导更强的RNA沉默,暗示RNA沉默参与CP负调控CMV茎尖侵染过程。本研究首先利用瞬时表达系统,观察到2b蛋白能够抑制GFP诱导的RNA沉默,CPWT共表达能显著减弱2b的抑制效果,而CPRA对2b的抑制能力没有显著影响。GFP mRNA和siRNA积累量的杂交结果表明CPWT能够增加siRNA的产生效率,从而减弱2b的抑制子活性。通过接种野生型拟南芥,以及RDR6、SGS3等siRNA扩增通路相关基因的功能缺失拟南芥突变体,发现CPWT主要是促进依赖于寄主RDR6/SGS3的次级siRNA的产生,诱导更强的抗病毒RNA沉默,从而负调控病毒的茎尖侵染。进一步实验证明,CPWT的N端13-19位碱性氨基酸能够介导CP非特异性结合RNA并抑制其翻译,进而招募RDR6/SGS3复合体诱导次级siRNA扩增。CP的N端连续碱性氨基酸区域在黄瓜花叶病毒属其它病毒也保守存在,本研究证明这些病毒的CP都能够减弱2b的抑制子活性。此外,CMV的CP还能减弱其它沉默抑制子的功能,暗示CMV的CP在自然侵染状态下对多种病毒协同侵染过程具有影响。前人研究表明CMVFny株系2b转基因拟南芥发育异常,主要是因为2b与AGO1互作并影响内源miRNA途径。我们进一步在2b超表达植株中转入CPWT,观察到2b引起的发育异常会变弱甚至消失,并且一些受2b诱导的内源基因积累水平也恢复正常,说明CPWT能够影响2b对于miRNA途径的调控。同时,CPRA共表达也能对2b的内源miRNA调控通路具有影响,说明这些CP对2b这一功能的影响不是通过诱导次级siRNA的扩增或者抑制2b蛋白的积累量等原因。体内和体外实验表明CP与2b发生互作,进一步减弱2b与AGO1的互作,释放AG01并正常行使体内miRNA通路。综上所述,CP与2b之间的相互作用影响着病毒在寄主上的致病性。首先,CP通过促进siRNA的产生效率,诱导更强的抗病毒RNA沉默;同时,通过翻译抑制降低抑制子2b的积累水平,这两方面的因素导致侵染后期不能进行茎尖侵染的现象。其次,CP通过竞争性结合2b,减弱2b与AG01的互作,使AG01在miRNA途径中正常发挥作用。以上两种都是病毒自我弱化的新机制,保证了寄主相对正常的生长状态,有利于病毒的长期侵染。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41
【图文】：
在切割的过程中ｄｓＲＮＡ或者具有茎环结构的ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ初级转录物被ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ逡逑（Ｄｉｃｅｒ或Ｄｒｏｓｈａ）切割产生ｓＲＮＡＡＲＢ作为辅助因子帮助ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ完成切害ｌＵＲＮａｓｅ逡逑ＩＩＩ可以分为三类（图１－２），其中Ｃｌａｓｓ邋Ｉ是在细菌和酵母中发现的，只有一个ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ逡逑催化结构域连接着双链ＲＮＡ结合结构域（ｄｓＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ｄｓＲＢＤ）；邋Ｃｌａｓｓ邋ＩＩ和逡逑Ｃｌａｓｓ邋ＩＩＩ包含两个ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ催化结构域，Ｃｌａｓｓ邋ＩＩＩ还含有解旋酶结构域以及ＰＡＺ逡逑（Ｐｉｗｉ／Ａｒｇｏｎａｕｔｅ／Ｚｗｉｌｌｅ）结构域（Ｚｈａｎｇ邋ｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑通过对细菌如b2ｊ／Ｚｃｍ邋（Ａａ）邋ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ进行结构解析，发现ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ以同源逡逑二聚体的形式发挥作用，同时预测了邋ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ切割ｄｓＲＮＡ的模型。ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ的ＰＡＺ逡逑结构域能够结合ｄｓＲＮＡ有两个核苷酸的Ｙ突出端，使得两个ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ结构域距离逡逑ｄｓＲＮＡ自由端大约２０邋ｎｔ
菌的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白进行Ｘ－ｒａｙ晶体结构解析，发现在ＰＡＺ和ＰＩＷＩ两个结构域之间逡逑还存在ＭＩＤ第三个结构域，ＭＩＤ结构域含有一个高度碱性的口袋，能够特异地结合逡逑ｓＲＮＡ的５＇磷酸基团从而将ｓｉＲＮＡ锚定到Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白中（图１－４）邋（Ｙｕａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００５）。逡逑根据Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白所具有的功能域可以将真核生物的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白家族分成逡逑两个组：ＡＧＯ邋以及邋ＰＩＷＩ邋亚家族（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍａｒｄ，邋２００８）。Ａｒｇｏｎａｕｔｅ邋蛋白是一逡逑个高度保守的蛋白，但是它在不同的组织中积累量有很大的差异（Ｄｏｅｒｋｓｅｔａｌ．，邋２００２）。逡逑不同生物体编码蛋白的数量差别也很大，比如酿酒酵母不编码Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白，但是逡逑裂殖酵母能够编码一个Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白；线虫可以编码２７个Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白（Ｐｅｔｅｒｓ逡逑ａｎｄ邋Ｍｅｉｓｔｅｒ，邋２００７）。模式植物拟南芥能够编码１０个ＡＧＯ蛋白，从ＡＧ０１到ＡＧＯ１０。逡逑这１０个蛋白根据蛋白相似性被分为三类：其中ＡＧＯｌ、ＡＧ０５和ＡＧＯ１０为一类；逡逑ＡＧ０２、ＡＧ０３邋和邋ＡＧ０７邋为一类；ＡＧ０４、ＡＧ０６、ＡＧ０８邋以及邋ＡＧ０９邋为一类（Ｊｅａｎｅｔ逡逑ａｌ．，２００２）。其中ＡＧ０１、ＡＧ０２、ＡＧ０７以及ＡＧＯ１０能够参与转录后基因沉默（Ｆａｎｇ逡逑ａｎｄ邋Ｑｉ，２０１６；邋Ｑｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）；邋ＡＧ０４和ＡＧ０６能够参与转录水平的基因沉默，参与甲逡逑基化过程（Ｈａｍｅｒａｅｔａｌ．
或者膜结构中进行复制来抵抗ＲＮＡ沉默，也有可能通过快速地复制以及运动来躲避逡逑ＲＮＡ沉默（Ｓｃｈｗａｒｔｚ邋ｅｔａｌ．，邋２００２）。不同的ＶＳＲｓ序列以及结构之间是多样化的，暗示逡逑它们在ＲＮＡ沉默途径的不同过程中发挥抑制作用（图１－５）邋（Ｃｓｏｒｂａ邋ａｎｄ邋Ｂｕｒｇｙｄｎ，邋２０１６）。逡逑不同ＶＳＲｓ发挥抑制子功能的机制可以总结为以下几个方面：影响ｓｉＲＮＡ的产生以逡逑及稳定性；影响ＲＩＳＣ复合体的形成；影响ＲＮＡ沉默信号的扩X椀取Ｏ旅婢咛褰樯苠义希郑樱曳⒒右种谱庸δ艿幕啤ｅ义希保保矗庇跋欤螅椋遥危恋牟约拔榷ㄐ藻义喜《厩秩局参锘峥焖儆盏迹遥危脸聊郑樱夷芡ü髦址绞揭种疲遥危脸聊腻义掀鹗肌Ｔ冢遥危脸聊揪吨校郑樱医岷纤矗螅椋遥危晾匆种疲遥危脸聊且桓龉惴旱耐惧义暇叮热纾裕拢樱值模校保埂ⅲ茫停值模玻狻⒙砹迨恚俨《臼舻模龋悖校颍铩⑻鸩嘶ㄒ恫《惧义仙倌蹋九拢伲郑┑囊种谱樱校玻钡群芏嗖《镜模郑樱遥蠖寄芄唤岷纤矗螅椋遥危铃澹ǎ粒睿洌颍澹麇义希澹翦澹幔欤澹玻埃埃埃诲澹牵酰镥澹澹翦澹幔欤垮澹玻埃保保诲澹伲邋澹澹翦澹幔欤澹玻埃埃常诲澹伲邋澹幔睿溴澹校幔簦澹欤澹玻埃埃担╁
本文编号：2748070
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41
【图文】：
在切割的过程中ｄｓＲＮＡ或者具有茎环结构的ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ初级转录物被ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ逡逑（Ｄｉｃｅｒ或Ｄｒｏｓｈａ）切割产生ｓＲＮＡＡＲＢ作为辅助因子帮助ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ完成切害ｌＵＲＮａｓｅ逡逑ＩＩＩ可以分为三类（图１－２），其中Ｃｌａｓｓ邋Ｉ是在细菌和酵母中发现的，只有一个ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ逡逑催化结构域连接着双链ＲＮＡ结合结构域（ｄｓＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ｄｓＲＢＤ）；邋Ｃｌａｓｓ邋ＩＩ和逡逑Ｃｌａｓｓ邋ＩＩＩ包含两个ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ催化结构域，Ｃｌａｓｓ邋ＩＩＩ还含有解旋酶结构域以及ＰＡＺ逡逑（Ｐｉｗｉ／Ａｒｇｏｎａｕｔｅ／Ｚｗｉｌｌｅ）结构域（Ｚｈａｎｇ邋ｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑通过对细菌如b2ｊ／Ｚｃｍ邋（Ａａ）邋ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ进行结构解析，发现ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ以同源逡逑二聚体的形式发挥作用，同时预测了邋ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ切割ｄｓＲＮＡ的模型。ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ的ＰＡＺ逡逑结构域能够结合ｄｓＲＮＡ有两个核苷酸的Ｙ突出端，使得两个ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ结构域距离逡逑ｄｓＲＮＡ自由端大约２０邋ｎｔ
菌的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白进行Ｘ－ｒａｙ晶体结构解析，发现在ＰＡＺ和ＰＩＷＩ两个结构域之间逡逑还存在ＭＩＤ第三个结构域，ＭＩＤ结构域含有一个高度碱性的口袋，能够特异地结合逡逑ｓＲＮＡ的５＇磷酸基团从而将ｓｉＲＮＡ锚定到Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白中（图１－４）邋（Ｙｕａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００５）。逡逑根据Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白所具有的功能域可以将真核生物的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白家族分成逡逑两个组：ＡＧＯ邋以及邋ＰＩＷＩ邋亚家族（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍａｒｄ，邋２００８）。Ａｒｇｏｎａｕｔｅ邋蛋白是一逡逑个高度保守的蛋白，但是它在不同的组织中积累量有很大的差异（Ｄｏｅｒｋｓｅｔａｌ．，邋２００２）。逡逑不同生物体编码蛋白的数量差别也很大，比如酿酒酵母不编码Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白，但是逡逑裂殖酵母能够编码一个Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白；线虫可以编码２７个Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白（Ｐｅｔｅｒｓ逡逑ａｎｄ邋Ｍｅｉｓｔｅｒ，邋２００７）。模式植物拟南芥能够编码１０个ＡＧＯ蛋白，从ＡＧ０１到ＡＧＯ１０。逡逑这１０个蛋白根据蛋白相似性被分为三类：其中ＡＧＯｌ、ＡＧ０５和ＡＧＯ１０为一类；逡逑ＡＧ０２、ＡＧ０３邋和邋ＡＧ０７邋为一类；ＡＧ０４、ＡＧ０６、ＡＧ０８邋以及邋ＡＧ０９邋为一类（Ｊｅａｎｅｔ逡逑ａｌ．，２００２）。其中ＡＧ０１、ＡＧ０２、ＡＧ０７以及ＡＧＯ１０能够参与转录后基因沉默（Ｆａｎｇ逡逑ａｎｄ邋Ｑｉ，２０１６；邋Ｑｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）；邋ＡＧ０４和ＡＧ０６能够参与转录水平的基因沉默，参与甲逡逑基化过程（Ｈａｍｅｒａｅｔａｌ．
或者膜结构中进行复制来抵抗ＲＮＡ沉默，也有可能通过快速地复制以及运动来躲避逡逑ＲＮＡ沉默（Ｓｃｈｗａｒｔｚ邋ｅｔａｌ．，邋２００２）。不同的ＶＳＲｓ序列以及结构之间是多样化的，暗示逡逑它们在ＲＮＡ沉默途径的不同过程中发挥抑制作用（图１－５）邋（Ｃｓｏｒｂａ邋ａｎｄ邋Ｂｕｒｇｙｄｎ，邋２０１６）。逡逑不同ＶＳＲｓ发挥抑制子功能的机制可以总结为以下几个方面：影响ｓｉＲＮＡ的产生以逡逑及稳定性；影响ＲＩＳＣ复合体的形成；影响ＲＮＡ沉默信号的扩X椀取Ｏ旅婢咛褰樯苠义希郑樱曳⒒右种谱庸δ艿幕啤ｅ义希保保矗庇跋欤螅椋遥危恋牟约拔榷ㄐ藻义喜《厩秩局参锘峥焖儆盏迹遥危脸聊郑樱夷芡ü髦址绞揭种疲遥危脸聊腻义掀鹗肌Ｔ冢遥危脸聊揪吨校郑樱医岷纤矗螅椋遥危晾匆种疲遥危脸聊且桓龉惴旱耐惧义暇叮热纾裕拢樱值模校保埂ⅲ茫停值模玻狻⒙砹迨恚俨《臼舻模龋悖校颍铩⑻鸩嘶ㄒ恫《惧义仙倌蹋九拢伲郑┑囊种谱樱校玻钡群芏嗖《镜模郑樱遥蠖寄芄唤岷纤矗螅椋遥危铃澹ǎ粒睿洌颍澹麇义希澹翦澹幔欤澹玻埃埃埃诲澹牵酰镥澹澹翦澹幔欤垮澹玻埃保保诲澹伲邋澹澹翦澹幔欤澹玻埃埃常诲澹伲邋澹幔睿溴澹校幔簦澹欤澹玻埃埃担╁
本文编号：2748070
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