苹果树腐烂病菌全基因组解析及两个外泌蛋白被植物识别的机制研究

发布时间：2020-07-10 00:02

【摘要】：由Valsa mali引起的苹果树腐烂病是危害苹果生产最为严重的病害之一,该病菌主要侵染皮层和韧皮部,导致树皮腐烂,严重时可致整树枯死,但基因组序列的缺乏严重限制了在分子水平对其致病机理的解析。病原菌与植物长期的协同进化过程中,病菌分泌毒性蛋白来调控植物的生理过程和免疫反应以促进病菌的侵染,但这些蛋白也很容易被植物识别并激发免疫反应。利用基因组分析研究苹果树腐烂病菌适应性侵染定殖树皮的机理,明确病菌分泌的毒性蛋白被植物识别的机制,将有助于理解病害的成灾规律、植物的抗病机制及制定有效的防治策略。因此,本研究在完成了苹果树腐烂病菌基因组测序的基础上,通过进行比较基因组分析及致病相关基因的预测鉴定,并探明了鉴定到的两个病菌分泌蛋白VmPR1c和VmEXLX1被植物识别的机制,获得的主要结果和结论如下:基因数量和基因水平转移驱动苹果树腐烂病菌适应性定殖树皮。利用高通量测序及光学图谱辅助拼接,获得了高质量的V.mali基因组序列,其完整度为96.7%,包括13条染色体级别的scaffolds。V.mali分泌蛋白酶的最适pH大多为酸性,并发现对真菌在酸性环境中正常生长至关重要的G01家族在V.mali基因组中显著扩张。V.mali基因组含有大量的胞壁降解酶类,但相比其它真菌扩张的主要为果胶酶类,而降解木质纤维相关酶类相对较少,并且降解木质素的关键酶AA5家族基因在腐烂菌基因组中缺失;此外,大部分果胶酶基因在侵染过程显著上调表达,经免疫细胞化学分析显示,腐烂菌主要降解苹果树皮中的果胶。相比其它真菌,V.mali的次生代谢基因簇数量显著增多,在侵染过程上调表达的主要为非核糖体多肽类基因。基因水平转移分析鉴定到的32个基因,功能涉及与环境微生物竞争、氮利用和致病等,可能在驱动病菌适应性定殖树皮中发挥重要作用。Expansin-like蛋白VmEXLX1被植物SRLK识别。VmEXLX1在侵染早期上调表达,表明VmEXLX1可能是重要的致病因子。过表达该基因后,病菌的致病力显著降低,在本氏烟中瞬时表达后诱导细胞死亡并显著提高本氏烟对核盘菌的抗性,表明VmEXLX1可被植物识别并激发免疫反应。亚细胞定位分析发现,VmEXLX1定位于植物细胞膜,并且信号肽缺失后不能在烟草中诱导细胞死亡,表明VmEXLX1很可能在质外体发挥功能。进一步利用质谱、双分子荧光互补和免疫共沉淀分析,在本氏烟中鉴定到一个与VmEXLX1互作的受体激酶NbSRLK1。瞬时表达NbSRLK1可以诱导细胞死亡、ROS积累和胼胝质沉积,且NbSRLK1促进VmEXLX1的降解,而VmEXLX1促进NbSRLK1诱导的细胞死亡。PR1-like蛋白VmPR1c被植物Skp1降解后激发免疫反应。三个PR1-like基因在病菌侵染早期都上调表达,其中VmPR1c敲除和过表达突变体的致病力都显著降低,且在本氏烟中瞬时表达可诱导细胞死亡、ROS积累和胼胝质沉积,表明VmPR1c被植物识别并激发免疫反应。通过删除突变和western blot分析发现,VmPR1c诱导的细胞死亡需要翻译后修饰;信号肽缺失则不能诱导细胞死亡,信号肽切割位点附近的插入或删除突变均可影响蛋白的降解、翻译后修饰和诱导细胞死亡的能力。蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理,都不能有效抑制VmPR1c的降解;进一步的删除和点突变分析发现,CAP功能域中的3个α螺旋区域单独都能介导GFP融合蛋白的降解,而NTE和CTE功能域中的脯氨酸则起保护蛋白的作用。亚细胞定位试验表明,VmPR1c定位于植物的细胞质和细胞核。通过酵母双杂交筛选及双分子荧光互补验证,鉴定到一个苹果的互作蛋白MdSkp1。瞬时表达分析发现,MdSkp1可以显著促进VmPR1c的降解及其诱导的细胞死亡,并且VmPR1c不能在沉默NbSkp1的本氏烟中诱导细胞死亡,表明Skp1识别并介导了VmPR1c诱导的细胞死亡。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.611.11
【图文】：

序列,真菌,效应,蛋白

因组学分析不仅发现毒性基因通常位于活跃的基因组区域，还发现基因水平物病原真菌的基因组重塑具有重要作用。一个寄主特异性蛋白类毒素基因 To 个 hAT 转座酶基因被发现从 S. nodorum 水平转移到 Pyreni-repentis(Friesen et al., 2006)。除了基因水平转移，最新研究发现整个染色体也转移。番茄致病菌 F. oxysporum 的一些特异的染色体可以从致病菌株转移到非，进而产生新的致病菌株(Ma et al., 2010)。基因水平转移不仅可以在同一物种离株间发生，也可在不同物种间发生甚至跨界转移，如细菌-真菌、真菌-卵nes & Richards, 2014)。应蛋白是病菌分泌的促进侵染定殖的蛋白，通常与寄主植物的蛋白发生互作序列的完成，极大地加快了新的效应蛋白的鉴定。效应蛋白通常是小的分泌功能未知(Rep, 2005)。候选效应蛋白通常从蛋白组序列中预测得到（图 1-1）, 2016)。然而，大量基于基因组学分析鉴定到的候选基因仍缺乏深入的研究。列为预测鉴定重要毒性基因提供了宝贵资源，而进一步的基因功能分析（如反）将有助于明确这些基因的功能。

植物细胞壁,真核,病原菌,真菌

物病原真菌 Pyrenophora teres 和 Pyrenophora tritici-repentis 基因组中只鉴定到 16 个HGTs，占基因总数的 0.1%(Sun et al., 2013)；在 6 个植物基因组的 4866 个基因中只鉴定到 9 个真菌相关的 HGTs，占比不到 0.2%(Richards et al., 2009)。相比细菌基因组，真菌基因组的进化主要来自于基因家族扩张、基因复制、基因缺失等(Wapinski et al., 2007)。尽管 HGT 对真菌基因组的进化影响较小，但对真菌生物学表型的影响很可能非常显著，如提高真菌对生态环境的适应性。例如，真菌中对糖代谢和环境适应性非常重要的果糖转运蛋白很可能经历了多次 HGT 过程(Coelho et al., 2013)。HGT 还可以显著影响植物病原真菌的致病性。已被试验验证功能的数十个真菌 HGT 在破坏植物细胞壁、利用植物营养、干扰植物生理过程和免疫反应等方面具有重要作用(Soanes & Richards, 2014)。真菌是渗透营养菌，需要通过分泌大量水解酶类降解大分子物质进而利用膜转运蛋白获取营养(Richards & Talbot, 2013)。除了获取营养，植物病原真菌分泌的水解酶类还可以降解植物细胞壁以促进侵染。植物细胞壁由果胶、纤维素、半纤维素和木质素等多糖构成，是抵御病原菌入侵的物理屏障。利用生物信息方法从多个病原真菌基因组中鉴定到了多种胞壁降解酶类的 HGTs，如果胶酶、阿魏酸酯酶、木聚糖酶等（图 1-2）(Richards& Talbot, 2013)。这些 HGTs 的获得，很可能有利于病菌破坏植物细胞壁。

示意图,基因,示意图,系统发育树

嘧茨骋?clade 内的基因包含进化关系远的物种的基因（图1-3）。通过系统发育树 bootstrap 值的高低和基因是否发生多次的复制或缺失来判断是否为 HGT，但基因的复制和缺失，经常导致其系统发育树类似于 HGT（图 1-4）。因此，还可以通过基因的功能注释进一步确认。比如，进化关系较远的物种间共有的基因，其4

【参考文献】