双斑侧沟茧蜂寄生斜纹夜蛾促进CypD与p53互作诱导寄主血细胞凋亡的研究

发布时间：2020-07-10 03:39

【摘要】：双斑侧沟茧蜂(Microplitisbicoloratus)是农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的天敌,通过寄生斜纹夜蛾幼虫而抑制寄主血细胞的免疫反应及寄主的生长发育。亲环素D(Cyclophilin D,CypD)属于亲环素蛋白家族,研究表明,哺乳细胞在受到凋亡刺激时,CypD可与p53结合形成复合物,通过线粒体途径诱导细胞凋亡。为探讨茧蜂寄生斜纹夜蛾过程中,茧蜂病毒诱导寄主血细胞凋亡以抑制其细胞免疫的分子机制,本研究通过凋亡检测、western blot、Co-IP、免疫荧光、基因沉默和线粒体膜电位检测等实验检测了寄生前后及茧蜂病毒感染后CypD与p53的表达、互作、细胞凋亡及线粒体变化情况。结果显示,茧蜂的寄生导致斜纹夜蛾幼虫血细胞p53、CypD上调及促进CypD与p53相互作用,线粒体膜电位的下降,细胞色素C从线粒体释放,激活了 cl-caspase 3,且寄生导致寄主血细胞凋亡的增加。提取茧蜂病毒MbBV感染Spli221细胞24h后,MbBV感染促进了 CypD与p53相互作用,细胞内线粒体膜电位的下降,细胞色素C从线粒体释放,激活了 cl-caspase 3同时也伴随着细胞凋亡增加。而当用RNAi沉默斜纹夜蛾幼虫血细胞CypD可以挽救茧蜂寄生引起的寄主血细胞凋亡。同时,当用CsA抑制或siRNA沉默CypD时,发现,抑制或沉默CypD可以抑制CypD与p53相互作用,细胞内线粒体膜电位有一定的恢复;且CsA抑制或沉默CypD后,细胞凋亡率显著性下降。以上结果提示,MbBV可能通过促进CypD与p53相互作用来诱导细胞凋亡的发生。综上所述,本研究阐明了双斑侧沟茧蜂寄生促进了寄主血细胞CypD与p53相互作用,导致线粒体膜电位下降,细胞色素C从线粒体释放,激活cl-caspase 3,最终导致寄主血细胞凋亡。该研究为阐明茧蜂寄生抑制寄主斜纹夜蛾免疫反应的分子机制奠定了一定的理论基础,也为生物防治斜纹夜蛾提供新的研究靶点。
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.3
【图文】：

需要进一步研宄阐明。同时，在寄生前后斜纹夜蛾血细胞的转录组测序数逡逑据中发现，有２９９个基因被上调了，其中与细胞凋亡有关的ＮＦ－ｋＢ、ＡＫＴ、ｐ５３、逡逑ＣｙｐＤ等基因被显著性上调了（图１）；其中有２４４１个基因被显著性下降［１Ｑ】。也逡逑有研究表明，当双斑侧沟茧蜂寄生斜纹夜幼虫６天后，寄主血细胞中ＣｙｐＤ显著逡逑性上调［１１，１２］，并诱导ｍＰＴＰ孔道开放，使细胞色素Ｃ、ＡＩＦ等凋亡诱导因子从线逡逑粒体释放到细胞质中。其中ＡＩＦ与ＣｙｐＡ相互作用进入细胞核中，导致ＤＭＡ片逡逑段化，最终导致细胞凋亡［１３］。但是关于ＡＩＦ与ＣｙｐＡ是如何进入细胞核中导致逡逑ＤＮＡ片段化的这一作用机制还未阐明，需要进一步研宄。同时发现在双斑侧沟逡逑茧蜂寄生斜纹夜蛾后，寄主ＣｙｐＤ发生乙酰化，且ＣｙｐＤ乙酰化水平与细胞凋亡逡逑有关［１２］。同时，研宄发现双斑侧沟茧蜂寄生斜纹夜蛾幼虫后翻译起始因子ｅＩＦ４Ａ逡逑在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平均被显著下调［１４］

３．２邋ｐ５３与细胞凋亡逡逑ＭＤＭ２作为ｐ５３的一个靶基因，可与被ｐ５３转录并活化表达。通常情况下，ｐ５３逡逑与ＭＤＭ２以二聚体存在，ｐ５３蛋白水平较低。当细胞受到凋亡信号刺激时，ｐ５３发逡逑生磷酸化修饰反应，同时ＭＤＭ２发生磷酸化修饰反应，导致ｐ５３与ＭＤＭ２之间的逡逑结合被打破，从而来稳定ｐ５３，邋ｐ５３蛋白水平增加并产生后续的活化反应。同时ｐ５３逡逑通过激活其上下游的靶基因Ｂａｘ、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５等诱导Ｇ（）／Ｇｊｊｊ细胞周期的阻滞，逡逑促进细胞凋亡，修复ＤＮＡ损伤，调节细胞的衰老等生命活动当细胞不能修逡逑复其ＤＮＡ损伤时，ｐ５３就会通过调控Ｂｄ－２和Ｂａｘ基因的表达使细胞发生凋亡逡逑Ｂｃｌ－２阻止细胞色素Ｃ等阔亡因子从线粒体释放，从而抵抗细胞凋亡｜６Ｗ７１；而Ｂａｘ逡逑９逡逑

分别用ａｎｔｉ－ＣｙｐＤ和ａｎｔｉ－ｐ５３抗体孵育，显影后，结果发现：ＭｂＢＶ病毒感逡逑染促进了邋ＳｐＵ２２１细胞ＣｙｐＤ与ｐ５３相互结合，且ＭｂＢＶ感染后ＣｙｐＤ与ｐ５３相逡逑互结合增强（图１０Ａ）；该研宄结果与活体水平寄主血细胞的结果是一致的。逡逑同时本实验提取茧蜂病毒ＭｂＢＶ感染Ｓｐｌｉ２２１细胞２４ｈ后，提取细胞总蛋白逡逑分离线粒体蛋白，用ａｎｔｉ－ＣｙｐＤ对总蛋白进行免疫沉淀，将免疫沉淀产物进行逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验，分别用ａｎｔｉ－ＣｙｐＤ和ａｎｔｉ－ｐ５３抗体解育，显影后，结果发现：逡逑ＭｂＢＶ感染促进了线粒体中ＣｙｐＤ与ｐ５３的相互作用且相互作用增强（图１０Ｂ）。逡逑因此，我们认为ＣｙｐＤ与ｐ５３的相互作用可能介导了线粒体体途径的细胞凋亡。逡逑这一结果与茧蜂病毒ＭｂＢＶ感染下ｐＩＺＴ－ｐ５３与ｐＩＺＴ－ＣｙｐＤ在细胞中的定位由细逡逑胞核到细胞质的变化情况是相符的。为了进一步探讨茧蜂寄生促进斜纹夜蛾逡逑ＣｙｐＤ与ｐ５３相互作用导致ｍＰＴＰ孔道的开放是否由茧蜂病毒ＭｂＢＶ介导的，于逡逑是本实验提取茧蜂病毒ＭｂＢＶ感染Ｓｐｌｉ２２１细胞２４ｈ后，用ＪＣ－１线粒体膜电位逡逑检测试剂盒检测线粒体膜电位变化情况（图１０Ｃ），结果发现：ＭｂＢＶ感染Ｓｐｌｉ２２１逡逑细胞２４ｈ后线粒体膜电位也显著下降（图１０Ｄ）

【参考文献】

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本文编号：2748407