花生疮痂病菌光生物学及全基因组序列分析

发布时间：2020-07-11 02:10

【摘要】：花生疮痂病(Elsino?arachidis)是我国花生主产区的重要的真菌病害。近年来,发生普遍,危害严重,现已成为花生产业持续发展中亟待解决的植保问题。课题组前期研究发现,该病菌能够产生一种橘红色、具有光敏活性的傒醌类真菌毒素,经鉴定为痂囊腔菌素(Elsinochrome,ESC)。傒醌类毒素影响寄主植物的代谢过程,在Alternaria,Cercospora和Elsino?等多种重要病原真菌侵染过程中作为重要的致病因子和毒力因子发挥作用。探究植物病原真菌毒素在病原菌致病过程中的作用及方式、生物合成途径及其调控机制,对于揭示病原菌侵染途径、致病机制和互作机理具有重要意义。由于国内外尚缺乏花生疮痂病菌的全基因组信息和分子研究体系,病菌致病因子、毒力相关次生代谢、ESC毒素生物合成途径、调控网络尚不明确,病菌侵染和致病、变异和进化、寄主与病原互作分子机制研究尚属空白,无法为抗病育种和防控策略创新提供理论基础。本文通过对花生疮痂病菌光生物学分析,并通过对全基因组序列分析及毒素合成相关基因簇的挖掘,初步预测毒素的生物合成途径调控基因,为花生疮痂病菌致病机制的研究及毒素的生物合成机理提供理论基础。1.明确了花生疮痂病菌光生物学光对真菌生长发育及次生代谢具有重要调控作用。通过系统研究光质、光强和光周期对E.arachidis(LN-JH-C01、LN-SY-A01和LN-FT-H01)菌落形态、生长发育及毒素含量的影响,结果发现,光参与病菌生长发育及次生代谢。光强度0~20μEm~(-2)s~(-1)为菌株生长最适范围,30d菌落直径可达20.07~23.83mm,光强大于100μEm~(-2)s~(-1)时,生长速率减小,菌落直径仅为11.67~19.00mm;蓝光培养条件下,菌落直径最大,30d可达21.03~23.00mm,红光和绿光处理下,仅为15.27~18.13mm;不同光周期处理对菌落生长无显著差异。产毒最适光强为100μEm~(-2)s~(-1),30d产毒量为31.63~82.31 nmol plug~(-1),光强为200μEm~(-2)s~(-1)时,产毒量显著降低,仅为4.04~10.35 nmol plug~(-1);蓝光处理毒素含量增加,3株菌株分别为79.00 nmol plug~(-1),27.68nmol plug~(-1)和87.10 nmol plug~(-1),红光和黑暗条件下,未检测到毒素。研究表明,光参与花生疮痂病菌毒素的生物合成,但Elsino?种间影响效应明显不同,供试菌株中E.ampelina受光强、光质和光周期变化影响相对较小。2.探究了花生疮痂病菌毒素组分及其生物活性花生疮痂病菌毒素经分离纯化,得到R_f值为分别为0.025,0.05,0.18,0.4和0.5的五种不同组分,全波长光谱扫描发现,五种组分的紫外吸收峰存在明显差异,其中组分1和组分2的紫外吸收峰分别位于460nm和516nm,其它3种组分与粗毒素的紫外吸收峰位点相同,分别在460nm,516nm和560nm。生物活性测定发现,各组分均可引起幼嫩花生叶片(15d)产生坏死斑,其中组分2所引致的坏死面积最大,但接种成熟叶片(45d)后,只有组分2和组分3可引致坏死斑。接种毒素后叶片活性氧清除酶CAT、POD和SOD动态变化测定结果表明,组分2和组分3接种后,酶活性均呈先上升后下降的趋势,且组分2和组分3接种后叶片的电导率随接种时间增加而升高,96h达最大值,分别为82.95%和78.37%。电导率变化是监测细胞膜完整性的指标,研究证明了毒素导致寄主细胞膜系统损伤,致使细胞死亡的主要原因之一,明确了花生疮痂病菌毒素在致病过程中的生理机制。3.首次揭示了花生疮痂病菌全基因组生物信息学信息花生疮痂病菌全基因组序列测序经拼接、组装和注释后,获得6.28 Gb的高质量测序数据,基因组总长约为33.18 Mb,GC含量为48.24%。基因组包含9174个蛋白编码基因,其中编码分泌蛋白的基因比例为8.0%(734个分泌蛋白),转运蛋白相关基因(TCDB)124个,含有信号肽的蛋白编码基因949个,跨膜蛋白编码基因1,829个,以及127个非编码RNA和13个假基因。通过基因组功能注释分析,共有8644个蛋白编码基因被注释得到(94.22%),其中GO,KEGG以及KOG分析分别注释到3237个、3055个和4958个基因,分别占基因总数的35.28%、33.30%和54.04%。基因功能注释结果中占比较高的为翻译后转运和分子伴侣,信号转导机制,碳水化合物的转运和代谢,氨基酸转运和代谢以及次生代谢产物的生物合成转运及代谢。此外还注释到与病原菌自身解毒作用相关基因和抗氧化活性功能基因。基因组与PHI数据库对比得到2,752个基因,约占30.0%,其中包括次生代谢合成关键基因,细胞色素P450,转运蛋白等相关基因。通过分子数据分析获得CAZy(602个)、细胞色素P450(79个)以及ABC超家族转运蛋白(57个)和MFS超家族转运蛋白(190个)等基因家族中致病相关基因。花生疮痂病菌基因组信息分析和挖掘为进一步深入探索病菌致病机制和毒素生物合成途径奠定了可靠的分子数据基础。4.明确了次生代谢相关PKS基因簇功能信息及ESCB1光表达调控使用antiSMASH2在线工具对E.arachidis的基因组序列中次生代谢基因簇进行分析发现,基因组中含有PKS,NRPS和PKS-NRPS等基因簇在内的86条次生代谢基因簇,经系统发育树分析,其中有6个与ESC(EVM0003759,定名为ESCB1),Melanin(EVM0004732、EVM0005880)和T-toxin(EVM0005988、EVM0002563、EVM0006869)生物合成相关的聚酮合酶基因。光暗处理下ESCB1表达量与毒素产生量趋势相同,光下表达量显著高于黑暗处理,进一步证明ESCB1是ESC生物合成的关键基因,且其合成途径与光紧密联系。ESCB1所在PKS基因簇共含有13个预测基因,主要包括MFS超家族转运蛋白编码基因2个(EVM0006582和EVM0006794),细胞色素P450基因1个(EVM0002495),单氧酶编码基因1个(EVM0001150),甲基转移酶编码基因2个(EVM0007299和EVM0001135),水解酶编码基因1个(EVM0008491)及Zinc finger转录因子1个(EVM0002638)等。基因簇基因功能预测对于ESC毒素生物合成途径及调控网络的研究具有重要意义。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.652
【图文】：

真菌毒素,尾孢菌,痂囊腔菌素,枝孢

异尾孢菌素（Isocercosporin）Cercospora spp.卡弗他丁C (Calphostin C)枝孢素(Cladochrome)弗莱菌素（Phleichrome）Cladosporium cucumerinumCladosporium cladosporioidesCladosporium phlei痂囊腔菌素（Elsinochromes） Elsino species竹红菌素（Hypocrellins）异竹红菌素（Isohypocrellin）Hypocrella bambusaeGraphis hematites菌寄生菌素（HypomycinA）竹黄菌素（Shiraiachromes）其他傒醌类Other perylenequinonesHypomyces spp.Shiraia bambusicolaBulgaria inquinans4,9-dihydroxy-3,10-perylenequinone Cercosporin Elsinochromes Phleichrome

尾孢菌,生物合成途径

沈阳农业大学硕士学位论文13图1-2 尾孢菌素生物合成途径Fig.1-2 Cercosporin biosynthesis pathway（Margaret et al. 2009）近年来在对ESC的研究过程中，发现除efPKS1基因调控ESC的合成外，另有其他相关基因参与调控作用，且控制ESC合成的基因簇尚不明确。傒醌类真菌毒素的生物合成是在多种酶的催化和复杂的基因调控下完成的，因此明确该毒素生物合成途径、催化酶系统、代谢机理、调控网络仍需要更加深入的研究。1.5 傒醌类真菌毒素的应用及展望卡弗他丁C（Calphostin C）是蛋白激酶C的有效抑制剂，并且也已被用于癌症治疗的研究（Olivo et al. 2007）。Hypocrellins及其相关衍生物已在国内被用于药物研究，并且已对它们在光动力学肿瘤治疗中的用途以及它们的抗病毒性质进行了广泛研究。相关的金丝桃素是用作抑郁症的草药的圣约翰草（Hypericum perforatum）的组分（Nahrstedtet al. 2010）。尽管金丝桃素作为抗癌剂具有缺陷，但是金丝桃素的衍生物正在被合成并且在光动力学肿瘤治疗中被测试（Waser et al. 2007）。在农业应用中

菌落形态,病原菌,菌丝生长,光强

沈阳农业大学硕士学位论文LN-FT-H01，LN-JH-C01，LN-SY-A01 虽然在菌落形态上差异明显，但进化树分析显示（图 2-1A），供试三株病原菌均属于花生疮痂病菌。2.2.2 光强对病原菌生长发育及毒素产生的影响2.2.2.1 光强对病原菌菌落形态和菌丝生长的影响光强对于花生疮痂病菌的菌落形态和生长速率有显著影响（图 2-2）。光强度在 5~20μE m-2s-1的变化范围内，花生疮痂病菌的菌落形态无明显差异，气生菌丝发达，菌落边缘有明显暗红色晕圈。而光强为 50μE m-2s-1或更高强度的光处理条件下，菌落形态上更加紧凑致密，LN-FT-H01 和 LN-JH-C01 气生菌丝着红色。光强度 0~20μE m-2s-1为花生疮痂病菌生长最适光强范围，菌落直径为 20.67 ~23.83mm。光强大于 50μE m-2s-1，菌落直径随光强增大而降低，200μE m-2s-1菌落直径仅为 11.67~13.13mm。不同种间对于光强的响应差异明显，E. ampelina 菌落直径变化较小，并且菌落颜色均呈暗红色，形态无明显变化。而 E. fawcettii 在 0-200 Jm-2s-1光强度处理下与 E. arachidis表现出相似的光适应性。

【相似文献】