人参皂苷对毁灭柱孢菌的作用及机制研究

发布时间：2020-07-11 03:10

【摘要】：植物分泌次生代谢产物作为防御物质,抵御微生物、昆虫以及动物等侵害。植物病原菌在长期侵染植物的同时,逐渐进化出了相应的机制来解除次生代谢产物的毒性,这使得植物与病原菌间的互作过程错综复杂。人参皂苷是人参分泌的一类次生代谢产物,但未能抵御某些人参病原菌的入侵。其中,人参锈腐病是人参种植区分布较广,并且发病时间较长的一种病害。本文以人参皂苷和人参锈腐病菌为研究对象,探讨两者间的相互作用及作用机制。研究菌种的选择:对四株从不同种植区病参上分离得到的人参锈腐病菌进行菌种鉴定和比较,发现四株真菌均为柱孢属真菌,但不属于同一个种。选用人参根总皂苷中含量最高的Rb1作为反应底物检测四株真菌转化皂苷的能力,发现四株真菌都能够转化人参皂苷Rb1,但代谢途径不同。菌种sp.1和sp.3的代谢路径为Rb1→G-XVII→F2,但菌种sp.3酶解出的G-XVII量极少;菌种sp.2和sp.4除了能水解出G-XVII外,还能够代谢出少量的Rd,代谢路径为Rb1→G-XVII/Rd→F2。植物病原菌通过分泌糖苷酶降解皂苷的毒性,菌种sp.1酶解Rb1时只生成一种中间产物G-XVII,且代谢出的G-XVII量最多,推测其分泌的胞外糖苷酶活力相对较高,有利于通过分离纯化获得单一的糖苷酶,因此选用菌种sp.1作为后续的研究对象。经鉴定,菌种sp.1为毁灭柱孢菌。通过研究毁灭柱孢菌的糖苷酶探讨皂苷的酶促降解与毁灭柱孢菌致病性的关系。用超滤、硫酸铵沉淀、阴离子吸附层析和分子筛层析等方法分离毁灭柱孢菌发酵液中的糖苷酶,结果发现毁灭柱孢菌分泌的糖苷酶行使β-1,2-葡萄糖苷酶活性时需要辅酶的参与,在辅酶存在的情况下Rb1的酶解产物为G-XVII。由于无法通过分离得到毁灭柱孢菌中能够酶解皂苷的全酶,因此从天然皂苷及其酶解产物对真菌生长的影响来研究糖苷酶在毁灭柱孢菌侵染人参时发挥的作用。用琼脂稀释法测定一株人参病原菌(毁灭柱孢菌)和四株非人参病原菌(玉米穗腐病菌、玉米大斑病菌、大豆疫霉根腐病菌和水稻稻瘟病菌)对人参根总皂苷、根皂苷中含量最高的六种单体皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1)及其代谢产物的敏感性。对毁灭柱孢菌来说,人参根总皂苷、二醇型皂苷单体Rb1和Rb2能够明显地刺激菌丝的生长,但他们的代谢产物却对菌丝的生长表现出明显的抑制作用。三醇型皂苷单体能够微弱地抑制毁灭柱孢菌的生长。但天然皂苷和皂苷的酶解产物都能抑制非人参病原菌的生长,且酶解产物的抑制能力更强。实验还发现,无论是人参病原菌还是非人参病原菌都能够分泌降解二醇型皂苷的胞外糖苷酶。以上的结果都能说明毁灭柱孢菌对皂苷的酶解能力与致病性无关。以膜甾醇为靶点研究毁灭柱孢菌是否由于缺乏甾醇导致皂苷无法插入其细胞膜使细胞破裂。经鉴定,毁灭柱孢菌的细胞膜上主要含有四种甾醇,其中麦角甾醇的含量最高。这表明,毁灭柱孢菌并非由于缺乏膜甾醇使皂苷无法表现出抑菌活性。分别用麦角甾醇构建脂质体、用毁灭柱孢菌的脂质构建模拟细胞膜并制备毁灭柱孢菌的原生质体,从不同层面研究皂苷与毁灭柱孢菌膜甾醇的相互作用。皂苷对脂质体和模拟细胞膜的作用基本相同,人参二醇型皂苷Rb1可以与甾醇形成复合物破坏脂质体和模拟细胞膜的完整性,而三醇型皂苷Re不能与甾醇结合。对原生质体而言,虽然人参根总皂苷和单体皂苷都能够破坏毁灭柱孢菌的原生质体,但不同皂苷对原生质体的作用趋势并不相同,随着皂苷浓度的增加,人参根总皂苷和二醇型皂苷Rb1对原生质体的毒害作用逐渐减弱,但三醇型皂苷Re、Rg1以及Rb1的代谢产物G-XVII和F2对原生质体的毒害作用却明显增加。这种作用趋势与皂苷对毁灭柱孢菌菌落生长的作用趋势一致。人参皂苷对原生质体的作用与对膜甾醇的作用并不相同,推测毁灭柱孢菌细胞膜上或细胞内还存在其他能够识别皂苷并与皂苷作用的物质。通过对毁灭柱孢菌进行全基因测序,从基因组水平筛选可能识别皂苷的物质。毁灭柱孢菌基因组的大小为60.4 M,GC含量为51.8%。通过生物信息学预测,获得了可能识别皂苷的2095个跨膜蛋白、455个典型分泌蛋白、3403个非经典分泌蛋白和170个毒性效应因子,为后续深入研究毁灭柱孢菌与人参的互作网络信号通路奠定了基础。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.675
【图文】：

病原菌,互作,植物,无毒基因

原菌互作时则会启动水杨酸信号传导途径[11]。1.1.2 植物与病原真菌的互作模型在植物与病原菌长时间共同进化的过程中，形成了非常复杂的互作机制，多植物和病原菌互作的模型先后被提出。1947 年，Flor 通过研究亚麻和亚麻锈菌小种的特异抗性，提出了基因对基假说（Gene-for-Gene Hypothesis）。寄主植物含感病基因（r）和抗病基因（R），时病原菌含毒性基因（Vir）和无毒基因（avr）。只有当含抗病基因的寄主与无毒基因的病原菌互相作用时，寄主才能表现出抗病性，其他的情况都能使寄感病（图 1-1）[12,13]。此假说已经在几十种不同的植物与其病原菌的关系中被实。

模型图,植物抗病性,模型

1-2 植物抗病性识别与表达的受体-配体模型[ Receptor-ligand model for the recognition and exof plant disease resistance[15]

假说,效应因子,分子,病原

3的警戒假说[16]。红色：“警卫”分子，灰色：植R，蓝色：靶蛋白，橘色：疾病 III 型效应因子rd hypothesis for R-protein function[16]. Red: guaB-LRR, blue: target protein, orange: type 3 effectnes 和 Dangl 提出了锯齿模型（Zigzag Model）程可以分为四个阶段：首先，植物通过病原菌tors, PRRs）感知微生物相关分子模式或病原ated molecular patterns, MAMPs; pathogen-as，触发 PAMPs 引起的免疫反应（PAMP-triggere

【参考文献】