新型致病疫霉抑菌剂的筛选及抑菌机制研究

发布时间：2020-07-12 03:28

【摘要】：致病疫霉(Phytophthora infestans)属于茸鞭生物界卵菌门卵菌纲腐霉目腐霉科疫霉属。1845年至1852年间,由致病疫霉诱发的马铃薯晚疫病造成了著名的爱尔兰大饥荒。至今,晚疫病仍然是世界马铃薯生产的主要威胁,造成了巨大的经济损失。化学农药防控是晚疫病防治的主要方式,但长期大量使用化学农药可导致严重的环境污染、食品安全和人类健康等问题。而且由于病原菌快速产生的抗药性,使大量化学农药药效逐渐减弱甚至丧失。综上,研发有效、安全及环保的生物农药是保障马铃薯生产,减少经济损失和环境污染的重要措施。TOR(Target of Rapamycin)蛋白激酶广泛存在于真核生物中,具有高度保守性,其突变能够导致细胞死亡。然而TOR蛋白激酶是否存在于致病疫霉菌中,作为农药的靶点能否达到有效控制该病原菌的作用,目前尚无定论。针对上述假设,本论文开展了以下6个方面的研究:1)依据致病疫霉的全基因组功能基因序列进行了生物信息学分析,结果表明在致病疫霉中存在高度保守的TOR蛋白激酶同源基因。2)利用TOR蛋白激酶抑制剂处理致病疫霉以验证上述结论,发现抑制剂AZD8055(化学式:C_(25)H_(31)N_5O_4,CAS:1009298-09-2)效果最好,能够全面高效地抑制菌丝生长、产孢量、孢子萌发及致病力。3)对AZD8055(下称AZD)抑制致病疫霉的机制进行了初步分析。转录组和蛋白磷酸化组学的关联分析表明AZD可能作用于致病疫霉PiTOR蛋白激酶,通过抑制PiTOR蛋白激酶的直接底物PiS6K和PiS6K的直接底物PiRPS6的磷酸化,对下游生物学功能进行调控。4)研究了利用RNAi技术验证PiTOR蛋白激酶的功能。以致病疫霉PiTOR为靶标设计并人工合成RNAi片段,结果表明RNAi片段能够有效地抑制致病疫霉生长、发育和分化。这一结果证明PiTOR蛋白激酶在致病疫霉生理功能中作用显著,是防治该病原菌的有效靶点。5)以上述研究为基础,筛选了能够靶向抑制致病疫霉PiTOR的天然化合物并进行了效果评估。本研究筛选并评估了褪黑素(化学式:C13N2H16O2,CAS:73-31-4)防治致病疫霉的可行性。结果显示褪黑素能够显著抑制致病疫霉菌丝生长,改变病原菌细胞的超微结构,减少其致病力,降低其抗逆能力。特别重要的是,褪黑素能与化学农药协同抑制马铃薯晚疫病,具备减少化学农药用量并增强其药效的潜力。6)进行了转录组和蛋白磷酸化组学的关联分析以初步探究褪黑素防治致病疫霉的作用机制。结果表明褪黑素可能通过抑制PiTOR蛋白,下调PiTOR蛋白的直接底物PiS6K和PiS6K的直接底物PiRPS6的磷酸化,抑制蛋白质代谢,达到防治致病疫霉的作用。此外,褪黑素还能够调控一些与抗逆、抗药、致病相关的基因表达以及蛋白磷酸化,抑制致病疫霉的抗逆、抗药以及致病能力。这些研究结果的创新点和意义在于:1)首次揭示了以致病疫霉PiTOR蛋白激酶为靶标能够有效防治晚疫病,为今后发展相关防治手段提供了科学基础。2)首次确认褪黑素对致病疫霉具有抑制效应,通过揭示可能的作用机制为利用天然产物研发防治晚疫病的生物农药提供了新思路。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.32
【图文】：

信号网络,酿酒酵母

图 1.1 酿酒酵母中 TORC1 信号网络图（引自 Virgilio 等[77]）Figure 1.1 The TORC1 signaling pathway in Saccharomyces cerevisiae

信号网络,酿酒酵母

图 1.1 酿酒酵母中 TORC1 信号网络图（引自 Virgilio 等[77]）Figure 1.1 The TORC1 signaling pathway in Saccharomyces cerevisia

示意图,基本结构,蛋白,结构域

1 绪论OR 蛋白的基本结构酒酵母中 TOR 蛋白分子量大（两个 TOR 蛋白约分别 281 和 282 kD本的结构域组成（图 1.3）。它的基本结构域从左到右（氨基端到羧 HEAT repeats、FAT（Focal adhesion targeting domain）、FRB、K（Carboxy-terminal FAT）[10]。它的氨基端由 20 个以上串联排列的ts 组成。HEAT repeats 一般由 40-50 个氨基酸组成，构成 α-螺旋的二级功能是调节蛋白互作[78, 79]。紧靠 HEAT repeats 的是 FAT 结构域，结构域[10]。雷帕霉素与 FKBP12 结合后，连接到 FRB 结构域，形成复制 TOR 蛋白活性的作用。激酶结构域（Kinase）位于 FRB 结构域之蛋白发挥激酶催化功能最主要的结构域[10]。在 TOR 蛋白的羧基端是，FATC 对 TOR 蛋白正常发挥功能是必不可少的，推测其功能在于反应，维系 TOR 蛋白的稳定[80]。

【参考文献】