miR319-MYB33-SPL9-DFR途径参与陆地棉对大丽轮枝菌的抗性响应

发布时间：2020-07-12 14:29

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小分子RNA,在植物响应病原菌入侵过程中起着重要作用。miR319作为发现最早的植物miRNA之一,其功能研究集中于植物叶和花的生长发育,在植物抗病响应机制方面的研究鲜见报道。本研究以陆地棉新的miRNA(ghr-miR319)为试验对象,其在陆地棉响应大丽轮枝菌入侵过程中表达水平上调,利用分子生物学和生物化学等方法研究其在陆地棉抗病响应过程中的分子机制。首先为鉴定棉花miRNA表达丰度建立了一套检测技术,通过分析棉花3个miRNA的表达谱来评析该技术体系的特性,优化了Stem-loop RT-PCR方法。研究设计了茎环特异性反转录、正向和通用反向3条引物,并梯度稀释cDNA和RNA,分析这些引物的扩增效率和检测灵敏度。结果表明,优化的Stem-loop RT-PCR方法具有较高的扩增效率和检测灵敏度,miR156和miR159扩增效率分别为102%和103.6%;总RNA检测灵敏度差异较大,分别为20 ng和2 pg。同时,成功地分析了miR156、miR159和miR5658在棉花根茎叶中的表达量。棉花miRNA表达丰度检测技术的建立为其miRNA相关研究提供了技术保证。接着,在棉花sRNA(small RNA)转录组学和降解组学数据库数据中鉴定了ghr-miR319和其靶基因GhMYB33,通过生物信息方法分析了两者相互作用的靶点和剪切位点。并利用Stem-loop RT-PCR和RT-qPCR方法分别检测了ghr-miR319及其靶基因GhMYB33在接种大丽轮枝菌第10天的相对表达水平,结果表明,它们分别为上调和下调表达,呈相反趋势。然后,利用VIGS技术分析ghr-miR319及其靶基因GhMYB33的抗性功能,培育了过表达和沉默ghr-miR319棉花植株,同时,也培育了沉默GhMYB33和GhSPL9基因植株;在对这些过表达和沉默植株接种大丽轮枝菌V991处理,分析它们的抗病性和抗病机制。结果表明,过表达ghr-miR319以及沉默GhMYB33和GhSPL9基因会促进陆地棉花青素积累,并且可以提高陆地棉对大丽轮枝菌的抗性;然而,沉默ghr-miR319则会抑制陆地棉对大丽轮枝菌的抗性,且陆地棉的花青素含量下降;进而,明确了植株的花青素含量与陆地棉抗病性的相关性。总之,这些研究结果表明miR319-MYB33-SPL9-DFR途径参与棉花对大丽轮枝菌的抗性响应。本研究工作为全面解析棉花miRNA抗黄萎病菌的分子机制和揭示植物先天免疫机理积累了科学数据;同时,也为从miRNA角度探讨棉花黄萎病可能的防治措施提供新的思路和途径。
【学位授予单位】：吉首大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.621.2
【图文】：

示意图,示意图,引物,序列

图 2.1 Stem-loop RT-PCR 检测 miRNA 示意图. 2.1 Schematic showing Stem-loop RT-PCR miRNA a表 2.1 miRNA 引物和序列Table 2.1 The miRNA sequences and primers序列 CGGCGGTGACAGAAGAGAGT-3'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGCTC-3'CCGCGCTTTGGATTGAAGGGA-3'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGAGC-3'CCGCGCATGATGATGATGATG-3'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATCAT-3'GCACTTTATTGGTCCATCATCC-3'GACACCTGGCTCTTTTTGATTC-3'GTGCAGGGTCCGAGGT-3'

棉花,琼脂糖凝胶电泳,反转录,性反转

2.2 棉花总 RNA 琼脂糖凝胶电泳arose gel electrophoresis photo of co注：R：根，S：茎，L：叶Note: R: root, S: stem, L: leafRT-PCR 在棉花中应用，必须先性反转录引物将 RNA 反转录成qPCR。对获得的 Ct 值和稀释梯扩增的 Ct 值和稀释梯度成显的斜率分别为 SmiR156= 3.27 和R 扩增效率分别为 102%和 10范围内引物扩增效率高。此外峰，无杂峰，进一步证明了引茎环特异性反转录引物、正向R 检测分析，能准确地反映模板

标准曲线,引物扩增,标准曲线,反转录

图 2.2 棉花总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图. 2.2 Agarose gel electrophoresis photo of cotton total 注：R：根，S：茎，L：叶Note: R: root, S: stem, L: leaf率检验m-loop RT-PCR 在棉花中应用，必须先对设计环特异性反转录引物将 RNA 反转录成 cDNA行 RT-qPCR。对获得的 Ct 值和稀释梯度进行 miR159 扩增的 Ct 值和稀释梯度成显著正相回归方程的斜率分别为 SmiR156= 3.27 和 SmiR1569 的 PCR 扩增效率分别为 102%和 103.6%。结拷贝数范围内引物扩增效率高。此外，RT-q出现单一峰，无杂峰，进一步证明了引物具有究设计的茎环特异性反转录引物、正向引物、A 的 PCR 检测分析，能准确地反映模板中 miR

【参考文献】