飞蝗几丁质脱乙酰基酶对肠道表皮发育和体表脂成分的影响

发布时间：2020-07-16 13:38

【摘要】：飞蝗是我国重要的农业害虫,个体较大,易于解剖观察,且具有敏感的RNA干扰系统,是渐变态昆虫的典型代表。由于长期使用化学农药防治蝗灾,不仅造成了环境的严重污染,同时导致了飞蝗对农药的抗药性增加。因此研发新型的环保生物杀虫剂是当前研究热点。在昆虫的生命周期里,虫体由于外骨骼的覆盖而不能自由伸展,导致昆虫每生长一个龄期,外骨骼就需要经历一次蜕皮再生过程,这个过程即为几丁质的代谢过程。几丁质是昆虫外骨骼的重要组成成分,除此之外在其他部分组织中也占有很大的比例。几丁质脱乙酰基酶在几丁质降解过程中发挥了重要的作用,可以催化几丁质转化为脱乙酰化的壳聚糖。因此,基于几丁质降解途径中起重要作用的功能基因研发生物杀虫剂是现阶段的可靠策略。本研究首先以飞蝗几丁质脱乙酰基酶(LmCDA1和LmCDA2)为研究对象,采用RNA干扰技术,观察干扰后飞蝗前后肠的外部形态;随后通过显微技术观察干扰后飞蝗前后肠表皮的显微结构,为探索这两个基因在飞蝗前后肠表皮发育中的功能提供了依据。其次,为探究几丁质脱乙酰基酶对飞蝗生态适应性的影响,本文通过伊红染色实验检测干扰飞蝗几丁质脱乙酰基酶LmCDA1和LmCDA2后是否影响伊红染料在其表皮的分布。此外,采用Bodipy染色和GC-MS技术进一步探究该基因对脂质运输和相关碳氢化合物含量的影响,然后通过检测对照组和干扰组对不同农药的敏感性和真菌的侵染程度推测该基因是否可以通过改变飞蝗表皮脂质分布造成其对农药敏感性的升高,将为基于几丁质脱乙酰基酶作为新型杀虫剂的研发靶标提供了重要的理论依据。本文主要从以下两个方面进行研究:一、几丁质脱乙酰基酶基因对飞蝗肠道表皮发育的影响采用RT-qPCR技术确定飞蝗几丁质脱乙酰基酶(LmCDA1和LmCDA2)在飞蝗五龄前肠和后肠每一天的表达模式,结果表明LmCDA1和LmCDA2均在飞蝗前肠蜕皮前期和蜕皮之后的表达量较高,而其仅在后肠蜕皮前期的表达量比较高。采用RNA干扰技术,在飞蝗五龄第二天注射双链RNA沉默LmCDA1和LmCDA2后,扫描光镜下解剖的肠道的外部形态,结果显示与对照相比并无肉眼可见的差异表型。HE染色后发现干扰这两个基因后并不影响前后肠的正常蜕皮,但是干扰飞蝗LmCDA2后导致飞蝗五龄第六七天的前、后肠的旧表皮和第八天的新表皮更厚;利用免疫组化技术进行飞蝗LmCDA1和LmCDA2在飞蝗前后肠表皮的定位,结果显示LmCDA1和LmCDA2在其肠道中的定位出现了分化:LmCDA1主要分布在前后肠表皮的细胞质和原表皮中,而LmCDA2主要分布在细胞质和上表皮中。二、几丁质脱乙酰基酶基因对飞蝗体表脂成分的影响采用伊红染料对五龄飞蝗体表进行着色,发现干扰LmCDA1和LmCDA2后的虫体表皮与对照组相比均有不同程度的伊红着色现象,推测这两个基因影响了飞蝗表皮的通透性;利用结合中性脂质的Bodipy染料对飞蝗二龄若虫表皮进行着色,激光共聚焦下观察表皮附近的脂滴分布,结果显示与对照相比,干扰LmCDA1和LmCDA2的飞蝗表皮外的脂滴数量明显减少,主要富集在表皮内靠近表皮的部位;采用GC-MS(气相色谱-质谱联用)检测对照组和注射双链RNA后的二龄若虫表皮碳氢化合物的成分和含量,结果表明干扰LmCDA1后飞蝗体表碳氢化合物的总量显著性的升高,推测干扰LmCDA1后飞蝗表皮碳氢化合物代偿性增高,干扰LmCDA2后飞蝗表皮碳氢化合物未出现显著变化;最后将五种农药通过点滴的方式作用于未干扰和分别干扰了LmCDA1和LmCDA2的二龄若虫,检测不同实验组对5种农药的敏感性,发现干扰两个基因后均对有机磷类农药敏感性增强且真菌侵染程度减弱。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.2
【图文】：

分子结构图,几丁质,分子结构

还会造成环境的严重污染[2]。近年来，由于全球频繁出现异常的气业生态环境的改变，蝗灾更易发生；且蝗灾具有爆发性，爆发后很业造成不可衡量的损失，所以研发新型绿色无污染的杀虫剂是当前[3]。丁质简介丁质（chitin）是由 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）通过β-l, 4 糖苷键连糖多聚物[4, 5]（化学结构如图 1-1）。几丁质是自然界资源最丰富，再生的天然聚合物之一，是仅次于纤维素的高聚化合物[6]。它常见于的细胞壁和大多数无脊椎动物中[7]。在昆虫体内，几丁质主要存在于化道的围食膜和体内某些特定组织中[8]。几丁质片层结构之间以规律压形成紧密的螺旋结构，最后平行排列形成几丁质[9]，有保持昆虫的外源病原微生物入侵的作用。因为几丁质广泛存在于昆虫体内，所作为害虫生物防治靶标之一。

几丁质,催化反应

飞蝗几丁质脱乙酰基酶对肠道表皮发育和体表脂成分的影响需要蜕去旧表皮，然后合成新表皮以满足躯体生长的需要。在新旧表皮的合成过程中有很多酶系的参与，其中几丁质脱乙酰基酶在几丁质降解过程中起了很的作用[10]。几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase）简称 CDAs，是一种糖酯酶家族的金[11]，它可以使几丁质脱乙酰化，将几丁质转化为不同程度去乙酰化的几丁质，壳聚糖[5]（反应过程如图 1-2），CDAs 在几丁质代谢中起重要作用。

飞蝗,前胃,消化道,横切

图 1-3 飞蝗消化道显微结构观察（A）和前胃结构横切图（B）Fig 1-3 Microstructure of the inner alimentary canal（A）and Proventriculus cross-section map（B）飞蝗的后肠位于肠道的最后端，具有重吸收水分和排除食物残渣的功能[24]。主要由三部分组成，分别是回肠（Il）、结肠（Co）和直肠（Re）。幽门彟以下的部分是回肠，回肠呈无色透明的膜质，是前粗后细的杯状结构，内部无齿有褶皱[30]，具有消化吸收的作用，平均长度为 4.0 mm，占消化道的 10.5%。结肠位于回肠之后，呈棕褐色，有明显的弯曲，由六条排列规则的纵行脊组成，内壁有齿，褶皱较多[31]，具有吸收水分的作用，平均长度为 2.8 mm，占消化道的 7.4%。直肠是肠道末端的膨大部分，有 6 条延伸的棕色纵肌，纵肌之间有 6 个无色透明的膜质结构，称为直肠垫，平均长度为 4.67 mm，占消化道的 12.3%。在显微镜下，可看到后肠的肠壁结构由内到外依次是几丁质层、细胞层、环肌和纵肌[32]（如图 1-4）。

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