禾谷缢管蚜钠离子通道功能特性的初步研究

发布时间：2020-07-17 12:52

【摘要】：禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(半翅目Hemiptera,蚜科Aphididae)是重要的麦类作物害虫,也是全球最重要的农业害虫之一。该虫不仅刺吸小麦汁液,而且传播大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),每年对全世界范围内的小麦产业造成严重的经济损失。目前,禾谷缢管蚜的防治主要依靠化学防治,而拟除虫菊酯杀虫剂因其具有广谱、高效、低残留等众多优点被广泛应用在蚜虫的防治上。杀虫剂长期大量、不合理的使用已经导致禾谷缢管蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性。昆虫电压门控的钠离子通道(Voltage-gated sodium channel,VGSC)是拟除虫菊酯等杀虫剂的作用靶标,钠通道基因突变是导致昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的主要原因。以往研究认为真核生物钠通道基因普遍由1个基因编码,而本实验室近期研究发现禾谷缢管蚜钠通道具有独特的结构,其由RpNa_vH1和RpNa_vH2两个基因编码。本研究不仅分析了禾谷缢管蚜独特钠通道基因的选择性剪接的类型以及突变位点,还对禾谷缢管蚜钠通道辅助亚基的功能进行了分析。研究结果可为深入阐明该虫钠通道基因独特结构与其功能的关系奠定基础,并且为以蚜虫独特钠通道为靶标的新型农药的设计与开发提供依据。主要研究结果如下:1、禾谷缢管蚜钠通道基因的选择性剪接类型利用公共数据库中的禾谷缢管蚜基因组数据,对禾谷缢管蚜钠离子通道基因结构进行分析,其中RpNa_vH1基因长度为15058 bp,有22个内含子;RpNa_vH2基因长度为6798 bp,含12个内含子。克隆禾谷缢管蚜钠通道基因并进行序列比对,在RpNa_vH1基因中共鉴定了3个可变剪接外显子,分别命名为rAS1、rAS2、rAS3,其分别对应果蝇钠离子通道的可选外显子j、组成型外显5、可选外显子b,总共存在5种剪接变体类型。在RpNa_vH2基因中发现了2个可变剪接外显子,分别命名为rAS4和rAS5,其分别对应果蝇钠离子通道的组成型外显子22的一部分、组成型外显子24,总共存在3种剪接变体类型。2、禾谷缢管蚜钠离子通道基因突变位点的检测本研究通过对禾谷缢管蚜氯氟氰菊酯抗性品系与敏感品系的钠离子通道基因编码区进行测序比对,在抗性品系中发现了5个新的突变位点:V107A、D263G、M284K、E325G以及S531G,其中D263G和M284K这两个突变位点位于昆虫钠通道上的拟除虫菊酯PyR2结合区域。3、干扰禾谷缢管蚜钠通道基因对其辅助亚基基因表达的影响根据RNAi及RT-qPCR结果表明,干扰禾谷缢管蚜钠通道RpNa_vH1基因后,RpTEH1、RpTEH2、RpTEH4以及RpTipE这四个基因的表达水平显著降低,但对辅助亚基RpTEH3基因的表达水平没有显著影响;干扰禾谷缢管蚜钠通道RpNa_vH2基因后,RpTEH1、RpTEH2、RpTEH3、RpTEH4和RpTipE基因的表达水平都显著降低。4、禾谷缢管蚜辅助亚基RpTipE在调节昆虫钠离子通道门控中的作用干扰禾谷缢管蚜辅助亚基RpTipE基因后导致钠通道基因RpNa_vH1、RpNa_vH2和辅助亚基RpTEH1、RpTEH2、RpTEH3以及RpTEH4基因的表达水平都显著降低。用LC_(50)氯氟氰菊酯处理禾谷缢管蚜时,注射dsTipE的禾谷缢管蚜死亡率显著低于对照组(注射dsGFP以及未注射)的死亡率,表明RpTipE基因的干扰显著降低了禾谷缢管蚜对氯氟氰菊酯的敏感性。5、禾谷缢管蚜辅助亚基在非洲爪蟾卵母细胞中的功能验证电生理实验表明,当DmNa_v22的cRNA单独注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行表达时只能检测到很小的钠电流,但将DmNa_v22的cRNA分别与DmTipE、RpTEH2、RpTEH3、RpTEH4和RpTipE的cRNA等物质量混合注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行共表达,检测到了更大的钠电流,表明RpTEH2、RpTEH3、RpTEH4、RpTipE以及DmTipE均提高DmNa_v22的钠电流并且缩短DmNa_v22表达所需时间。6、禾谷缢管蚜钠通道在非洲爪蟾卵母细胞中的功能验证本文还对禾谷缢管蚜钠通道的体外表达进行了初步探索,将禾谷缢管蚜钠通道cRNA单独或分别与DmTipE、RpTipE的cRNA等物质量混合注射到非洲爪蟾卵母细胞内进行表达,结果均未产生任何钠电流。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.122.2
【图文】：

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图 1-1 电压门控钠离子通道的门控过程及拟除虫菊酯类对动作电位影响示意图（Dong et al. 2014）Fig.1-1 Gating process of voltage-gated sodium channel and the effect of pyrethroids on action potential(Dong et al. 2014)钠离子不能自由通过神经细胞膜的磷脂双分子层，其跨细胞膜运输必须依靠钠离子通道。如图 1-1（a），钠通道的打开和关闭是由激活和失活这两个门控过程调节。当神经细胞处于静息状态时，钠通道处于完全关闭状态，当神经元的膜去极化时，钠通道被激活（通道打开），钠离子通过激活钠通道内流，使膜进一步去极化，导致动作电位不断上升。钠通道被激活几毫秒后，钠通道会迅速失活，失活过程不仅是使得动作电位下降，还在动作电位的终止中起重要作用。复极化后，钠通道从失活中恢复且激活门会关闭。失活和从失活中恢复使得钠通道完成了从失活状态到静息状态的转变，这保证了细胞膜恢复静息状态并准备下一个动作电位产生。因此，钠通道在神经细胞以及兴奋细胞的信号传导中起重要作用。此外，为了响应长时间的去极化（数秒至数分钟），钠通道会逐渐进入更稳定的缓慢失活的状态，该过程被称为慢失活。拟除虫菊酯类农药能够延长昆虫钠通道的开放时间，影响钠通道的快速失活，干扰神经冲动的正常传导（图 1-1（b）蓝色曲线），从而导致昆虫中毒死亡（Dong et al. 2014）。

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图 1-2 真核生物电压门控钠离子通道结构（Catterall 2012; Dong et al. 2014）Fig.1-2 The structure of voltage-gate sodium channel of eukaryotic (Catterall 2012; Dong et al. 2014)脊椎动物钠通道由一个 α 亚基和多个附属的 β 亚基组成（图 1-2）（Yu and Catterall2003）；α 亚基是功能实体，因此，一般提到的钠通道基因即指 α 亚基的编码基因（Catterall 2012）；β 亚基为功能辅助性亚基，在调节钠通道的功能中有辅助作用。β亚基通过非共价键或二硫键与 α 亚基相连（Brackenbury and Isom 2011）。哺乳动物的电压门控钠离子通道有 9 种亚型（Nav1.1-Nav1.9），分别由 9 个不同基因编码（Goldin et al. 2002; Catterall et al. 2003）。以往的研究认为，昆虫体内只有一个电压门控钠离子通道，其结构和脊椎动物钠通道相似，也是由 1 个基因编码（Dong et al.2014）；昆虫没有钠通道的 β 亚基，但在黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 等昆虫中发现了与脊椎动物 β 亚基功能相似的 TipE 和 TEH1-TEH4 辅助亚基（Wang et al. 2013）。将 TipE 作为 β 亚基替代品与 α 亚基共表达，结果明确显示 TipE 能代替 β 亚基起辅助蛋白作用（Feng et al. 1995; Warmke et al. 1997; Lee et al. 2000; Du et al. 2013）。TipE 蛋白和 TEH 蛋白不仅在结构组成上相同，还在辅助功能上相似，但在调控钠离子通道上

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类真核生物钠通道、禾谷缢管蚜等蚜虫的钠通道的结构图及其离子选择酸比对（Catterall 2012; Dong et al. 2014; Zuo et al. 2016a; Jiang et al. 20ructure of sodium channel of non-aphid eukaryotic or aphids such as R. pad acid of ion selective filter of sodium channel (Catterall 2012; Dong et al. 22016; Jiang et al. 2017)研究认为，昆虫只存在一个编码钠通道的基因，但近年来研究个基因编码（Amey et al. 2015; Zuo et al. 2016; Jiang et al. 2017

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