美洲南瓜白粉病病原菌鉴定及抗病基因的精细定位

发布时间：2020-07-19 01:26

【摘要】：南瓜属于葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita),其为一年生草本植物,具有营养丰富、产量高、食用及药用价值高等特点,在世界范围内广泛栽培。白粉病是南瓜生产中的重要病害之一,在世界各地普遍发生。白粉病的发生影响南瓜作物的正常生长,发病后期使南瓜无法正常进行光合作用以提供营养,导致收获时籽粒不饱满、果实产量及品质下降。目前南瓜白粉病的防治主要以化学防治为主,由于化学杀菌剂易对环境和人类健康造成威胁,还可引发白粉病菌产生抗药性从而增加防治难度。分离并克隆南瓜白粉病抗性基因,通过分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)培育抗病品种成为南瓜育种的主要研究方向之一。本研究对美洲南瓜白粉病病原菌及生理小种进行鉴定,并探究病原菌与美洲南瓜之间的互作反应。并对64份种质资源进行抗性鉴定,从鉴定出的抗感病材料中选取白粉病高抗自交系‘X10’及高感自交系‘JIN234’作为亲本,构建6世代群体,对分离群体进行遗传规律分析,通过BSA-seq策略、KASP分型技术以及CASP分子标记相结合对抗病基因进行精细定位,开发的分子标记可用于分子标记辅助育种工作的开展。研究内容如下:(1)试验通过白粉病病原菌形态观察及分子鉴定明确引起美洲南瓜白粉病的病原菌为单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii),利用国际通用的白粉病病原菌鉴别寄主对该病原菌的生理小种进行鉴定,该生理小种为2France。利用纯化的白粉病病原菌对64份南瓜种质资源进行抗性鉴定,其中13份种质资源表现出对该病菌的高抗性,15份材料表现为高感病性,在鉴定的种质资源材料中选取高抗病材料‘X10’作为母本,高感病材料‘JIN234’作为父本进行后续试验。(2)以抗病自交系‘X10’及感病自交系‘JIN234’为材料,通过曲利苯兰透明染色法观察白粉病病原菌与美洲南瓜的互作反应。接菌6h感病材料‘JIN234’孢子萌发长出芽管,接菌24h病原菌菌丝开始生长,96h病原菌分生孢子梗开始萌发;抗病材料‘X10’则在接菌48h孢子萌发出芽管,接菌120h次生菌丝生长。相比于感病材料‘JIN234’,抗病材料‘X10’受病菌侵染后芽管萌发数量较少、时间较晚,菌丝生长较慢,由于孢子芽管的萌发被阻断,使得抗病材料‘X10’表现出抗病性。(3)试验利用白粉病高抗自交系‘X10’及感病自交系‘JIN234’为亲本材料配制六世代群体进行遗传规律分析,抗感表型调查等级划分为6级(0、1、3、5、7、9)。F_1表现为抗性(1级),F_2群体表型有抗病型(0、1、3级)、中间型(5级)、感病型(7、9级)三类,植株抗感比例为3:1,BC_1P_2群体表型有抗病型(1、3级)、中间型(5级)、感病型(7、9级)三类,植株抗感比例为1:1。表明美洲南瓜白粉病抗性是由一对显性主效基因控制的。(4)试验通过BSA-seq策略对抗病基因进行初步定位,构建抗-感病池及两个亲本池,分别对4个池进行重测序。测序结果分析,将抗病基因定位在美洲南瓜10号染色体4.85Mb区间内。在区间内利用KASP基因分型技术对F_2群体210个单株进行扫描,将目标基因定位到M1940027和M2716228标记之间。利用CASP标记扫描1300株F_2单株以筛选重组单株,结合对应的F_(2:3)表型将抗病基因精细定位在标记PM.C2448658与PM.C2551764之间,标记间距离为103,106bp,定位区域内共有18个编码基因。(5)对精细定位区段内的18个基因注释进行分析,发现其中有3个基因均具有抗病性结构域RPW8。本试验对定位区间内4个基因进行基因表达量分析,与3个基因相邻的Cp4.1LG10g02500基因在高抗材料与高感材料接菌0-48h趋势变化均不明显,推测其与抗病性无关。高抗材料接种6h-48h Cp4.1LG10g02780基因表达量呈现上升趋势,高感材料接种6h-48h Cp4.1LG10g02780基因表达量呈现下调趋势,其余2个基因在0-48h内在P_1植株中的表达量低于P_2植株的表达量,因此初步确定Cp4.1LG10g02780基因为抗病候选基因。(6)试验利用分子标记PM.C2448658对2000株F_2群体筛选,并对各单株进行抗病性鉴定,田间种植表型观察结果与分子标记筛选基因型一致,证明此标记可用于分子标记辅助育种选择。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.421.12
【图文】：

东北农业大学农学硕士学位论文分析病原菌鉴定形态特征观察 倍光学显微镜对白粉病病原菌分生孢子、纤维状体及分生孢-1）。分生孢子为广椭圆形，长（28.61±3.51）μm，宽（19.1原菌分生孢子具纤维状体结构，每个分生孢子内纤维状体数目 3-1a）。分生孢子梗由孢子串生组成，长（98.54±13.65）μm，）。依据上述形态特征，初步判断美洲南瓜白粉病白粉菌为单xanthii）。

注: a-接菌叶片；b-空白对照图 3-2 南瓜幼苗接菌 10 d 后植株感病情况ation of susceptible plants after 10 d of Cucurbita pepo L. seedling分子鉴定粉病病原菌总 DNA，进行 PCR 扩增，测序得到长度约 564 bp 见图 3-3，该序列在 GenBank 上的授权登录号为 MH084745。通析，确定美洲南瓜白粉病病原菌 ITS 核苷酸编码序列中 1-29 位207 位为 ITS1 区段序列，208～361 位为 5.8S rDNA 全序列，3506～564 位为 28S rDNA 部分序列。利用 DNAMAN 软件将扩病原菌序列进行比对，结果见图 3-4。保守区域内没有差异，并 Podosphaera xanthii 序列一致性较高。系统进化树结果见图 3-5相比于 E.cichoracearum、E. polygoni、L. taurica 序列，其与甜anthii PMJS1）、苦瓜单囊壳（Podosphaera xanthii PM2）、美anthii MUMH808）、棉叶膏桐单囊壳（Podosphaera xanthii JGsphaera xanthii ET1）等亲缘关系最近。分子鉴定结果进一步证

注: a-接菌叶片；b-空白对照-2 南瓜幼苗接菌 10 d 后植株ible plants after 10 d of CucuNA，进行 PCR 扩增，测序列在 GenBank 上的授权登录瓜白粉病病原菌 ITS 核苷酸段序列，208～361 位为 5.28S rDNA 部分序列。利用 D比对，结果见图 3-4。保守nthii 序列一致性较高。系统acearum、E. polygoni、L. ta、苦瓜单囊壳（Podosphaer8）、棉叶膏桐单囊壳（PoET1）等亲缘关系最近。分子（Podosphaera xanthii）。

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本文编号：2761694