枣WRKY转录因子鉴定、响应植原体侵染过程中的表达特性及其功能预测

发布时间：2020-07-19 03:22

【摘要】：枣(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科(Rhamnaceae)植物,是我国的重要果树树种。枣树的栽培过程中常常伴随着病虫害的发生,其中最为严重的是由植原体侵染而引起的枣疯病,堪称枣树的癌症。为研究WRKY转录因子基因在枣疯病发病过程中可能发挥的作用以及枣与植原体的相互作用机制,利用生物信息学的方法,鉴定出枣WRKY转录因子家族的成员,并对枣疯病发病过程中部分枣WRKY转录因子的转录水平进行分析和荧光定量PCR试验验证,同时分析了水杨酸和茉莉酸甲酯处理后几个枣WRKY转录因子基因的表达量变化。主要结果如下:1、通过嫁接转染植原体,提取植原体侵染后不同时期的枣叶片RNA,进行转录组测序。根据转录组数据并结合NCBI数据库信息,鉴定出69个枣WRKY转录因子,并对其进行系统进化树构建,染色体定位,保守结构域比对及基序分析。结果显示69个枣WRKY转录因子都含有WRKY保守结构域,可分为Group I,Group II以及Group III 3个亚组,分别含有17、41、11个成员,且不均匀的分布在枣树的12条染色体上,在7号染色体上没有匹配到相应的ZjWRKY转录因子。2、从枣疯病发生过程中枣叶片的转录组数据中检测到28个ZjWRKY转录因子的差异表达主要集中在嫁接后38-52 w。对表达量上调的6个基因ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69进行荧光定量PCR验证,试验结果显示在枣疯病发病过程中ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61、ZjWRKY69基因表达量发生明显变化(上调)。说明这几个基因可能在枣树防御植原体的过程中发挥作用。3、为进一步分析研究枣WRKY转录因子在植原体防御过程中的潜在作用,我们用水杨酸和茉莉酸甲酯处理枣胚培苗,荧光定量PCR检测ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69基因在处理不同时间的表达量变化,试验结果显示SA处理后,ZjWRKY42和ZjWRKY52的表达量显著升高;MeJA的积累诱导了ZjWRKY42和ZjWRKY61的表达量发生较明显变化。4、构建了ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因的过表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,分别获得了15个转ZjWRKY8基因的抗性芽,28个转ZjWRKY52基因的抗性芽,16个转ZjWRKY61基因的抗性芽。5、ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因在烟草叶片中瞬时过量表达后,用0.1 mol·L~(-1)的H_2O_2处理叶片,结果显示ZjWRKY8、ZjWRKY61基因过表达的烟草叶片中CAT的活性水平都高于对照,而SOD活性只在0-12 h高于对照叶片;DAB组织化学染色结果显示ZjWRKY8过表达的烟草叶片中黄色沉淀明显增加。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.65
【图文】：

拟南芥,系统进化树,成员

3.2 枣 WRKY 转录因子与拟南芥 WRKY 家族的进化树分析及其分类依据枣WRKY蛋白与拟南芥WRKY蛋白的相似性进行聚类分析，将69个WRKY蛋白分为3个组Group I、Group II和Group III，且与拟南芥的分组相对应。根据枣与拟南芥的同源进化树（图2-1）可以看出，有17个ZjWRKY属于Group I；Group II中含有41个WRKY成员，可细分为II a 、II b、II c、II d、II e 5个亚组，所含WRKY成员分别为3个、11个、15个、3个、9个；Group III含有11个ZjWRKY成员。由图2-1发现，在每个分组中均包含有AtWRKYs和ZjWRKYs，如Group I中有17个枣WRKY转录因子，13个拟南芥WRKY转录因子，说明两个物种的WRKY转录因子在蛋白结构上有一定的保守性。同一个分组内

染色体,蛋白,染色体定位,位置

Fig. 2-1 The phylogenetic tree of WRKY transcription factors in jujube and Arabidopsis3.3 枣 WRKY 转录因子的染色体定位利用Mapinspect软件对枣WRKY蛋白进行染色体定位，结果如图2-2（图左侧cM为基因图距单位），只有43个枣WRKY基因可以定位到枣的11条染色体上，26个枣WRKY基因没有可以匹配的染色体定位信息（未获得染色体定位信息）。在枣的12条染色体上，7号染色体上没有定位到任何枣WRKY转录因子，其余11条染色体上都分布有不等数量的枣WRKY基因。11号染色体上分布最多，含有8个ZjWRKY基因（ZjWRKY30- ZjWRKY37），占11.60%，其次是1号染色体

基序,蛋白,多重序列,亚组

我们利用DNAMAN软件对枣WRKY蛋白进行多重序列比对，发现大部分WRKY转录因子都含有WRKYGQK的保守结构，而ZjWRKY23、ZjWRKY46是WRKYGKK结构，这两个转录因子都属于GroupII c亚组（图2-3）。利用MEME在线工具对枣WRKY蛋白的保守基序进行预测分析，得到10个保守基序，并将其命名为motif 1-motif 10（图2-4）。motif 1和motif 2包含有WRKY蛋白标志性的WRKYGQK结构域。motif 1结构最为保守，ZjWRKY40（Group II c）和ZjWRKY49（Group II b）以外的67个枣WRKY蛋白均含有该结构。10个WRKY转录因子不含有motif 2结构，分别为Group I的ZjWRKY1、11、49，GroupII a的ZjWRKY48，Group II b的ZjWRKY40、54，Group II e的ZjWRKY42以及Group III中的ZjWRKY3、13、26。其次motif 3、4、5也较为保守

【参考文献】