条锈菌重要致病因子PstGSRE1和PstCPK1致病机理研究及利用HIGS技术创制小麦持久抗条锈病材料
发布时间：2020-07-22 16:57
【摘要】：小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia stiiformis f.sp.tritici)引起的小麦重大病害,在世界范围内危害严重。利用抗病品种进行防治仍然是目前最经济最有效的方式。然而,条锈菌毒性变异频繁,新的毒性小种出现使得抗病基因不断被克服,同时新的抗病品种的选育速度远远滞后于毒性小种的更新速度。因此,研究小麦条锈菌的致病机理,寻找新的病害防控策略刻不容缓。小麦条锈菌作为活体寄生真菌,需要从活体细胞中吸收营养,并向寄主中分泌效应蛋白调控寄主的免疫反应,促进侵染。在锈菌与小麦的互作过程中的致病因子有很多,其中一类基因主要负责条锈菌的生长及致病能力,相对保守;另外一类能够分泌进入寄主的体内,通过调节寄主的免疫系统以促进病原菌侵染。效应蛋白是侵染过程中分泌到寄主中促进病原菌侵染的一类小分子蛋白,在长期的进化过程中,产生了可以被寄主特异识别并引起过敏性坏死反应的AVR蛋白和调节寄主免疫的其他效应蛋白。然而条锈菌中重要效应蛋白调控小麦的机理我们知之甚少。本研究选取锈菌富含甘氨酸丝氨酸的效应蛋白PstGSRE1进行研究,分析其序列特点,解析其变异特征;利用瞬时表达、亚细胞定位、寄主诱导的基因沉默(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)等方法,解析PstGSRE1的时空表达特征、毒性及无毒性功能;进一步通过蛋白互作技术获得其在小麦中的靶标蛋白并明确其靶标蛋白的功能。此外,本论文还利用寄主诱导的基因沉默技术(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)靶向沉默小麦条锈菌致病因子PstCPK1基因,创制了持久抗条锈病的转基因抗病材料。取得的主要结果如下:1.鉴定了1个小麦条锈菌富含甘氨酸和丝氨酸的效应蛋白PstGSRE1。序列分析发现其N端含有具有分泌功能的信号肽,未发现保守结构域。qRT-PCR分析发现PstGERE1在侵染初期表达量显著上调。毒性功能分析表明其可抑制Bax诱导的PCD;可抑制由EtHAn引起的胼胝质累积及非亲和菌株诱导的活性氧累积。亚细胞定位分析表明该效应蛋白在寄主体内活动活跃,并且呈现一种活跃的流动现象;2.瞬时沉默PstGSRE1,条锈菌的生长明显受到抑制,菌丝长度,菌落面积及吸器数量减少,产孢的数量和面积大幅减少。表明该效应蛋白对于锈菌毒性具有重要作用。通过构建PstGSRE1的RNAi转基因沉默载体,基因枪法获得该基因的永久沉默转基因植株,经过多代的抗病选育,在T4代获得3个抗病性提高的转基因株系(L33、L34、L43),以上结果表明PstGSRE1是条锈菌重要的致病因子;3.为了解析该效应蛋白在调控寄主免疫反应的机理,我们利用酵母双杂交系统筛选到了PstGSRE1的候选靶标蛋白,分别为TaLOL2、TaCAT1、TaCAT3、TaCIPK10等。利用酵母双杂交系统确认该效应蛋白与TaLOL2的C端互作,并进一步利用Pull-down技术和Co-IP技术确认了PstGSRE1与TaLOL2的互作关系;4.序列分析发现,效应蛋白靶标TaLOL2含有三个锌指结构,该结构具有结合DNA的功能,在小麦中高度保守;存在3个拷贝,分别在5A、5B、5D上,且不同拷贝间相似性达96%以上。利用BSMV-VIGS技术瞬时沉默TaLOL2发现沉默植株对小麦条锈菌的抗病性显著降低,活性氧和坏死面积显著减少。利用T3SS系统在小麦中过表达该蛋白能够显著降低孢子堆的数量,表明其为小麦抗条锈病的正向调控因子;通过小麦原生质体定位技术发现TaLOL2具有明显的核定位信号,并能在烟草中引起细胞死亡。5.PstGSRE1可以抑制TaLOL2诱导产生的坏死。荧光标记两个基因发现:在烟草中,TaLOL2在核中具有明显的累积,然而在效应蛋白存在的情况下,TaLOL2主要在细胞质中累积,导致其无法进入细胞核启动寄主免疫反应。表明条锈菌效应蛋白PstGSRE1通过干扰TaLOL2进核,从而抑制寄主免疫反应而利于病菌的侵染。;6.鉴定了小麦条锈菌重要致病因子蛋白激酶A的催化亚基PstCPK1。qRT-PCR分析发现,PstCPK1在条锈菌侵染初期表达量逐渐升高,18h达到峰值,随后逐渐降低。利用PstCPK1互补稻瘟菌CPK1突变体可以部分恢复其致病力。利用BSMV-HIGS瞬时沉默PstCPK1显著降低了条锈菌的毒性,组织学观察也发现病菌菌丝长度和菌落面积均显著下降。我们进一步构建PstCPK1永久沉默载体,通过基因枪转化法对小麦品种西农1376进行遗传转化,所获得的株系利用PCR鉴定并对阳性植株进行加代。经过多代抗病选育,在T4代获得2个抗病性提高的阳性转基因株系(L12和L18),并对插入小麦基因组的载体和所产生的小RNA分子进行分子鉴定,进一步明确了转基因株系的组织细胞学和分子水平的变化,初步探究了转基因株系的抗病分子机制。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.121.42
【图文】：
曾士迈 2002)，冬孢子和性孢子一般无侵染能力(Voegele, R T and Mendgen, K几种孢子均能寄生于不同的寄主。夏孢子、冬孢子以及担孢子的寄主主要是如小麦、大麦、燕麦等，有些杂草也可以成为它们的侵染对象，而性孢子和要侵染转主寄主小檗。锈菌的毒性变异主要源于在转主寄主上的有性生殖,近面的研究渐渐成为热点。具有双核、每个核里有一组染色体称为单倍型的夏利的环境条件下转化成由两个细胞组成的每个细胞都是单核二倍体的冬孢子过一次有丝分裂一次减数分裂分化出两组先菌丝，先菌丝上着生两种单核单子，具有（+）（-）两种不同的配型，这两种担孢子侵染小檗，并在小檗叶种性子器，一种产生受精丝，一种产生单核单倍体的性孢子，性孢子和受精这样的有性生殖过程在小檗叶片背面形成锈子器，锈子器产生很多锈子腔，释放很多双核单倍体的锈孢子，在小麦上侵染形成夏孢子，进行下一轮的侵染然条件下，有性阶段的周期通常是一年，在最适温度条件下，无性繁殖的周，而低温条件则需要几个月。经过这样复杂的有性生殖过程，锈菌的毒性变增加，条锈菌的这种有性生殖过程不仅为锈菌增加变异频率，也更加难以根主上的残留锈菌，这也为锈菌的防治增加了非常大的难度。
图 1-2 植物抗病性的分子基础Figure 1-2 A model illustrates the molecular mechanism of the plant immune system (Wang et a2016).3.2 基因对基因假说ETI 免疫反应经过长期的演化，形成了植物抗病基因对病原菌的效应蛋白类似一的识别关系。在亚麻锈菌的小种专化型抗性研究过程中，这种基因对基因的假说or(1971)首次提出。这种基因对基因的假说现如今已经证明存在于几十种不同的植原菌互作体系中，可以看作是一种较为普遍的植物体免疫病原菌的特异抗病性。这论提出：病原物侵染其寄主的时候会有两种不同的表现型，亲和体系和非亲和体系原菌分别含有毒性基因（a）和无毒基因（A），所对应的寄主则有感病基因（r）和基因（R）。无毒基因 V 可以被寄主的抗病基因 R 特异识别，迅速引发下游的过敏死反应。其他几种对应关系不能引起寄主的坏死反应，病原菌可以顺利侵染寄主，主患病。在之后的研究中，也发现了不仅仅存在这种一一对应的关系，也存在一个基因识别多个无毒基因或者多个抗病基因识别一个无毒基因的模式存在。对该理论
图 1-3： RNA 沉默用于发展植物病害控制策略的一般机制和潜在应用。Figure 1-3 General mechanism and potential application of RNA silencing for the development lant disease control strategies. (Cristiano et al. 2011).在 HIGS 中，RNA 转移是从宿主到丝状生物体。 然而，也存在向相反方向转移能性。 真菌从复制的转座子中产生沉默 RNA，经由真菌 Dicer 处理，然后转运到细胞中（最可能是双链形式的 siRNA），在那里它们与植物 AGO1 结合并沉默植物基因表达。如果 HIGS 是单步机制，那么沉默 RNA 必须过量。 然而，植物和真菌持产生具有传递性和扩增潜力的次级 siRNA，如病毒 RNA 沉默。 因此，来自宿主的低丰度 siRNA 可能在真菌中引发大的沉默效应，反之亦然：植物与丝状真菌之间界沉默需要涉及大量的 RNA 的转移。BSMV 沉默系统是单子叶植物中基因功能研主要工具，Yin et al. (2009)提出来用该系统研究小麦与条锈菌的基因功能。目前已量的小麦和锈菌的基因功能利用该系统进行研究。.5.4.3 小麦的遗传转化技术转基因育种是我国分子育种的主要方向，加强农艺性状，提高抗性是转基因育种
本文编号：2766088
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.121.42
【图文】：
曾士迈 2002)，冬孢子和性孢子一般无侵染能力(Voegele, R T and Mendgen, K几种孢子均能寄生于不同的寄主。夏孢子、冬孢子以及担孢子的寄主主要是如小麦、大麦、燕麦等，有些杂草也可以成为它们的侵染对象，而性孢子和要侵染转主寄主小檗。锈菌的毒性变异主要源于在转主寄主上的有性生殖,近面的研究渐渐成为热点。具有双核、每个核里有一组染色体称为单倍型的夏利的环境条件下转化成由两个细胞组成的每个细胞都是单核二倍体的冬孢子过一次有丝分裂一次减数分裂分化出两组先菌丝，先菌丝上着生两种单核单子，具有（+）（-）两种不同的配型，这两种担孢子侵染小檗，并在小檗叶种性子器，一种产生受精丝，一种产生单核单倍体的性孢子，性孢子和受精这样的有性生殖过程在小檗叶片背面形成锈子器，锈子器产生很多锈子腔，释放很多双核单倍体的锈孢子，在小麦上侵染形成夏孢子，进行下一轮的侵染然条件下，有性阶段的周期通常是一年，在最适温度条件下，无性繁殖的周，而低温条件则需要几个月。经过这样复杂的有性生殖过程，锈菌的毒性变增加，条锈菌的这种有性生殖过程不仅为锈菌增加变异频率，也更加难以根主上的残留锈菌，这也为锈菌的防治增加了非常大的难度。
图 1-2 植物抗病性的分子基础Figure 1-2 A model illustrates the molecular mechanism of the plant immune system (Wang et a2016).3.2 基因对基因假说ETI 免疫反应经过长期的演化，形成了植物抗病基因对病原菌的效应蛋白类似一的识别关系。在亚麻锈菌的小种专化型抗性研究过程中，这种基因对基因的假说or(1971)首次提出。这种基因对基因的假说现如今已经证明存在于几十种不同的植原菌互作体系中，可以看作是一种较为普遍的植物体免疫病原菌的特异抗病性。这论提出：病原物侵染其寄主的时候会有两种不同的表现型，亲和体系和非亲和体系原菌分别含有毒性基因（a）和无毒基因（A），所对应的寄主则有感病基因（r）和基因（R）。无毒基因 V 可以被寄主的抗病基因 R 特异识别，迅速引发下游的过敏死反应。其他几种对应关系不能引起寄主的坏死反应，病原菌可以顺利侵染寄主，主患病。在之后的研究中，也发现了不仅仅存在这种一一对应的关系，也存在一个基因识别多个无毒基因或者多个抗病基因识别一个无毒基因的模式存在。对该理论
图 1-3： RNA 沉默用于发展植物病害控制策略的一般机制和潜在应用。Figure 1-3 General mechanism and potential application of RNA silencing for the development lant disease control strategies. (Cristiano et al. 2011).在 HIGS 中，RNA 转移是从宿主到丝状生物体。 然而，也存在向相反方向转移能性。 真菌从复制的转座子中产生沉默 RNA，经由真菌 Dicer 处理，然后转运到细胞中（最可能是双链形式的 siRNA），在那里它们与植物 AGO1 结合并沉默植物基因表达。如果 HIGS 是单步机制，那么沉默 RNA 必须过量。 然而，植物和真菌持产生具有传递性和扩增潜力的次级 siRNA，如病毒 RNA 沉默。 因此，来自宿主的低丰度 siRNA 可能在真菌中引发大的沉默效应，反之亦然：植物与丝状真菌之间界沉默需要涉及大量的 RNA 的转移。BSMV 沉默系统是单子叶植物中基因功能研主要工具，Yin et al. (2009)提出来用该系统研究小麦与条锈菌的基因功能。目前已量的小麦和锈菌的基因功能利用该系统进行研究。.5.4.3 小麦的遗传转化技术转基因育种是我国分子育种的主要方向，加强农艺性状，提高抗性是转基因育种
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 李振岐;我国小麦品种抗条锈性丧失原因及其解决途径[J];中国农业科学;1980年03期
本文编号：2766088
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/2766088.html
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