沈阳和盖州地区萝卜病毒病的分子检测与鉴定

发布时间：2020-07-22 17:18

【摘要】：本研究通过透射电镜法观察和RT-PCR扩增技术对辽宁省沈阳地区和盖州地区萝卜叶片样品中的病毒进行了检测与鉴定,确定侵染辽宁省沈阳地区和盖州地区萝卜的病毒为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)中的芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)。本文测定了三个TuMV辽宁分离物的全基因组和十六个TuMV辽宁分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)序列,丰富了辽宁省沈阳地区和盖州地区萝卜病毒资源,为萝卜病毒病的防治工作奠定理论基础。(1)2017年5月,在辽宁省沈阳市采集到6个呈现泡状褪绿的萝卜样品,使用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察到700×13nm的线性病毒粒子。初步判定该病毒粒子为典Potyvius线性粒子。利用Potyvirus通用引物PVY-legpoty-F/R对所采集的样品进行RT-PCR扩增后得到1200 bp片段,克隆测序后进行Blast比对,结果表明该样品同芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的同源性最高。利用已经报道的扩增TuMV特异引物TuMV-CP-F/R在6个样品中均扩增到约1000bp的片段,包含完整的外壳蛋白(coat protein,cp)。同源性比对发现,6个样品的cp基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均高于90%,说明他们是用一个病毒的不同分离物。选取LN-sy分离物,基于美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上TuMV全基因组序列设计扩增6对引物,TuMV-1F/1R,TuMV-2F/2R,TuMV-3F/3R,TuMV-4F/4R,TuMV-5F/5R,TuMV-6F/6R扩增得到该样品上病毒的全基因组。该病毒的基因组由9855个核苷酸组成。基于cp基因进行同源性分析,发现沈阳地区萝卜样品与TuMV的中国分离物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)同源性最高,同源性为99.8%。基于cp基因构建系统发育树,发现TuMV LN-sy与TuMV的中国分离物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)在同一分支上。根据国际病毒分类委员会(International Committeeon Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次报告和2018版分类系统中报道的Potyviridae分类标准,断定LY-sy是TuMV的辽宁沈阳分离物。(2)2017年5月,在辽宁省盖州市采集10个呈现矮化或叶片斑驳的萝卜样品,使用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)在两种症状病叶中均观察到约800×13nm的线性病毒粒子。初步判定病样受到Potyvius病毒侵染。利用(1)中TuMV-CP-F/R引物在10个样品中均扩到约1000bp的cp基因。选取矮化症状的TuMV-GZ1分离物和叶斑驳症状的TuMV-GZ5进行全基因组测序,发现TuMV-GZ1和TuMV-GZ5基因组分别为9867nt和9856nt组成。基于cp基因进行同源性分析,发现TuMV-GZ1和TuMV-GZ5均与TuMV的中国分离物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)同源性最高,同源性为99.4%。基于cp基因构建系统发育树,两个分离物与TuMV的中国分离物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)聚在同一分支上。根据国际病毒分类委员会(International Committeeon Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次报告和2018版分类系统中报道的Potyviridae分类标准,断定TuMV-GZ1和TuMV-GZ5是TuMV的辽宁盖州分离物。这是辽宁省首次报道萝卜感染TuMV。
【学位授予单位】：沈阳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.31
【图文】：

11图 2.1 辽宁省沈阳地区采集的萝卜病叶图片e of disease leaves of Raphanus sativus L.collected in Shenyang Province粒载体EN（天根生化科技（北京）有限公司）购买大肠杆菌生物工程（大连）有限公司）购买 pMD-18T、pMD

第 2 章 沈阳地区萝卜病毒病的鉴定与序列分析结果分析卜病叶样品电镜观察结果鲜萝卜病叶于透射电镜下，进行病毒粒子观察，可见约 700×病毒粒子表面无包膜（图 2.2）。该病毒粒子从形态特征上显示 Potyvirus 属成员。osaic virus-[China: Brassica napus L. ] TuMV-[CN: Brassica napus L.] KF463308osaic virus-[China: Raphanus sativus] TuMV-[CN: Raphanus sativus] KR153038osaic virus-[China:Raphanus sativus] TuMV-[CN:Raphanus sativus] KR153040

沈阳大学硕士学位论文 LN-sy1 样品，利用六对引物（表 2.2）对萝卜病叶的 cDNA 进增，结果如图 2.4 显示，依次得到 1200bp（泳道 1）、1800bp（泳道 5）、1500bp（泳道 7）、1800bp（泳道 9）、1000bp（泳段，健康植物中无任何条带（泳道 2、4、6、8、10 和 12）。所克隆测序，经拼接得到全长基因组序列。

【参考文献】

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本文编号：2766107