草莓主要抗药性病害的环介导等温扩增（LAMP）检测

发布时间：2020-07-24 17:35

【摘要】：[目的]主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的炭疽病和由灰葡萄孢菌(Boteytis cinerea)引起的灰霉病是草莓生产上两大主要病害。化学防治是草莓生产上防治炭疽病、灰霉病两大病害的主要手段,病原菌群体对药剂的敏感性是决定防治效果的主要因素之一。传统的抗药性检测方法是将病原菌分离纯化后,转接在含药培养皿上,根据药剂对病原菌的生长抑制作用来鉴定是否为抗药性菌株,该方法工作量大,耗时长;本研究为了实现抗药性快速检测的目的,建立环介导等温扩增检测(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),在1~2 h内得到可靠的抗药性检测结果,能快速检测和监测病原菌的抗药性发展,从而合理指导用药。[方法]针对灰霉病,本研究通过错配碱基引物特异性鉴定抗药性菌株、优化反应组分和条件,从而建立抗药性LAMP快速检测体系。最后应用LAMP检测技术检测田间样品,同时将样品带回实验室分离培养,利用传统区分剂量法检测抗药性,结果和LAMP检测相比较,验证LAMP检测结果。针对炭疽病,本研究建立LAMP快速检测技术用于草莓苗期炭疽病的检测;随后,测定了草莓炭疽病菌的抗药性,分析其抗性分子机制,建立了草莓炭疽病菌抗药性LAMP检测方法。[结果]1.开发了一种环介导的等温扩增(LAMP)检测体系,设计错配引物,能快速检测灰葡萄孢菌β-tubulin基因上E198A突变基因型(对苯并咪唑类杀菌剂高抗);灰霉病菌E198A基因型LAMP检测的最佳反应条件为64℃,60 min;本研究中LAMP灵敏度是常规PCR的10倍。和区分剂量法的检测结果比较表明LAMP检测田间抗性菌株可达到100%的准确性。2.建立了LAMP快速检测体系,用于田间灰葡萄孢菌对甲氧基丙稀酸酯(QoIs)类杀菌剂的抗性监测和抗性发展风险评估,其中包含两个LAMP检测,其一能准确检测到灰霉病菌对Qo I类杀菌剂具有高度抗性的G143A突变体;其二能检测出灰葡萄孢中cytb基因上BCbi143/144内含子。LAMP检测的最佳反应条件为61℃,50 min,使用ALL-DNA-Fast-Out在10 min内对田间样品进行核提取前处理,以实现一步法快速检测。总之,本研究建立了一个快速灵敏的LAMP测定系统,用于灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险评估和监测田间抗药性。3.开发了一种直接用于草莓苗期炭疽病检测的LAMP体系,利用LFD(横向侧流试纸)及碱性聚乙二醇浸提等方法,快速进行田间样品前处理,实现田间病害快速检测。4.分别建立了LAMP快速检测方法,用于特异性检测胶孢炭疽菌对QoIs类杀菌剂高抗G143A突变基因型和对苯并咪唑类高抗E198A的突变体,检测结果和区分剂量法一致。[结论]本文研究结果初步实现了田间快速检测草莓主要抗药性病害的目的,对草莓生产上调整用药策略,提高药剂防治效果、减少药剂的使用量具有较大的现实意义。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.68
【图文】：

示意图,引物,示意图,区域

rakis 等利用 RFLP-PCR 对田间桃褐腐病菌（Monilinia laxa）突变，能特异性检测苯并咪唑类抗性 E198A 突变基因型[95]。ZioPCR 技术用于灰葡萄孢菌（B.cinerea）对苯并咪唑类杀菌剂抗性的检介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal AmplificP）检测技术导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是于 2000 年由明、报道的一种新型、方便快捷、灵敏度极高且廉价的核酸扩增方法[97]，原理是针对标靶序列 300bp 内的 6 个高度保守区域（F3c，F2c，Flc，B1，性的设计 4 条引物。引物的设计是该方法能否成功扩增的关键，FIP 是上游和 F2 区域组成)，其中 F2 区域与目的基因 F2c 区域互补；F3 是上游外引物 F3c 区域互补；BIP 是下游内引物（由 BIc 和 B2 区域组成），其中 B2 区B2c 区域互补；B3 作为下游外引物与目的基因的 B3c 区域互补（图 1.1）。

序列,引物,突变体,粗线

2 检测草莓灰霉病菌抗苯并咪唑类杀菌剂 E198A 基因型的 LAMP 体系的建立与应用有限公司提供。其他试剂盒：ALL-DNA-FAST-Out 裂解液（生工生物）、真菌 DNA 快速试剂盒（生物生工，上海）、质粒提取 SanPrep Column Plasmid mini-Preps盒（生工生物，上海）、SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒（生工生物，上海仪器：PCR 扩增仪（AB 公司），凝胶成像系统（Tanon），超级恒温水上海森信实验仪器有限公司），恒温加热器。.1.2 引物设计使用在线引物设计软件 Primer Explore V5（http://primerexplorer.jp/e/v5）灰葡萄孢菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性菌株 Cl-3 的 β-tubulin 基因（GeneBankQ790278.1）含有 198 位点突变的序列为模板，设计引物（图 3.1），并在 1引入错配碱基，对设计出的 6 套引物（表 3.1）。引物由上海生工生物公司，用 dd H2O 溶解后分装，4 ℃保存备用。

酶浓度,显色,聚合酶

9MFritrle2成的条管低合, 11; E198A 反MP 反应产物Figure 2.2 Detimers. Labelrain (S). Labecinerea withectrophoresis..2 Bst DN为了筛选成本就能达的浓度梯度条带，但颜管颜色变化低质量终浓合酶（8 U·μ反应管中含有物凝胶电泳图ter mining six1, 3, 5, 7, 9, 1el 2, 4, 6, 8, 1h the E198A m. Lane M reprcolors. TheNA 聚合酶选出最低但能达到快速检测度下均能扩增颜色变化并不化明显，由反浓度为 0.16 UL-1）是支有 E198A 基. b: LAMP 反x sets (S1 S611: the templa0, 12: the temmutation (E19resented the De positive sam酶量的优化能实现 LAM测目的的体增出条带，但不显著，当反应前紫色μL-1，即在持反应进行因型灰霉菌株反应产物可视6) of loop-meate DNA wasmplate DNA w98A). a: LAMDL2000 DNAmples were po化MP 反应的体系。如图 2但在质量浓当 Bst DNA色变为天蓝色在 25μL LA行的最少酶株 DNA 样品视化HNB显色ediated isothes extracted frowas extractedMP product deA marker. b: Hointed out by的聚合酶浓度2.3 所示，B浓度为 0.08聚合酶浓度色。说明体AMP 检测体酶量。品, 即管 2, 4,色图; 红色箭rmal amplificom the carbend from the isoetected on 1%HNB-based vy red arrows度，从而筛Bst DNA 聚U·μL-1时，度大于 0.08体系中 Bst D体系中 0.5 μ, 6, 8, 10, 12.箭头代表阳性cation (LAMndazim sensitolates of Botry% agarose gelvisual change筛选出以较低聚合酶在优化虽能扩增出U·μL-1时，DNA 聚合?

【相似文献】