辣椒疫霉病菌拮抗菌的筛选鉴定、培养条件优化及其抑菌作用的研究

发布时间：2020-08-05 06:34

【摘要】：辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引发的一种土传性病害,主要危害辣椒的茎、叶和果实,侵染后可造成植株萎蔫、落叶和果实腐烂。一旦发病,传播迅速,对辣椒生产构成极大威胁,常造成减产20%-30%,甚至造成毁田绝收,严重影响辣椒的产量和质量。当前,生产上主要采用甲霜灵、霜脲氰等内吸化学杀菌剂进行防治,但疫霉菌对使用过的内吸杀菌剂极易产生抗药性,而化学药剂防治为主的防治措施还会产生药剂残留以及环境污染等问题。所以,对辣椒疫病进行生物防治是当前辣椒生产可持续发展的必然选择。1.本研究从43个海南土壤样本中分离纯化筛选出了73株对辣椒疫霉病菌有拮抗作用的细菌菌株A1~A73,经过一系列抑菌试验发现菌株A60抑菌活性最高,对辣椒疫霉的抑菌圈半径高达11.63mm,继代培养后抑菌效果稳定。经生理生化特征及16S rDNA序列和系统发育树分析结果,鉴定拮抗菌A60菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。2.对拮抗菌A60的抑菌物质类型进行了初步研究,结果表明抑菌物质为水溶性,主要存在于发酵液上清液中,为胞外次级代谢产物。其在发酵液不同分离部分的抑菌效果:全菌液上清液菌悬液细胞破碎液。不同实施倍数发酵液对辣椒疫霉病菌的抑菌效果:10倍稀释的发酵液抑菌率可达到78.7%,20倍稀释液抑制率为62.8%。拮抗菌A60发酵液中的少量挥发性物质对辣椒疫霉病菌的菌丝生长有一定的抑制作用。A60对辣椒疫霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、梨黑斑病菌等病原菌均有明显的抑制作用。3.为提高A60发酵产物对辣椒疫霉病菌的拮抗效果,对其发酵培养基成分及发酵工艺进行优化:在筛选确定A60的最适碳源、氮源和无机盐的基础上,采用正交设计法优化可溶性淀粉、酵母粉和氯化钠的浓度,研究培养温度、pH、接种量、装液量等因素对A60抑菌活性的影响,最终确定了侧孢短芽孢杆菌A60的最佳发酵培养基及发酵条件为可溶性淀粉1%、酵母粉2%、氯化钠0.2%,起始pH为7.0,接种量2%,装量为100mL/250mL三角瓶,发酵温度为37℃。4.辣椒疫霉病在辣椒和甜椒上均有发生,本试验使用抑菌效果较好的侧孢短芽孢杆菌A60的无菌发酵液分别在辣椒和甜椒上进行防效试验。试验结果表明,加入拮抗菌A60无菌发酵液的辣椒,在第3d时防效可达到100%,第5d防效达95.71%,第7d仍可达到92.22%,说明拮抗菌A60能够明显的降低辣椒疫霉病在辣椒上的发病率和病情指数,并且具有很好的持效性。加入拮抗菌A60无菌发酵液的甜椒,在第3d时防效达到100%,第5d时为75.26%,第7d仍可达到73.20%,说明拮抗菌A60能够明显降低辣椒疫霉病在甜椒上的发病率,并具有较好的持效性,但在甜椒上的防效效果比在辣椒上的稍差一些,使用时应适当提高A60使用浓度。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.418
【图文】：

抑菌效果,抑菌物质,细胞破碎,发酵液

行抑菌谱的测定，观察抑菌效果，测定抑菌圈半径，计算抑菌率。不同浓度无菌发酵液对辣椒疫霉病菌的抑制效果将该拮抗菌无菌发酵液分别稀释成 10 倍、20 倍、40 倍、80 倍、160 倍，添加并混匀于基中。用打孔器在生长 5d 的辣椒疫霉病菌边缘打孔，取菌块接种于 PDA 平板中央，培养，以混入无菌水的平板作对照，待对照平板菌丝长满平皿时，测量各平皿菌落半径理 3 个重复，计算抑制率。确定不同浓度无菌发酵液对病原菌的抑制效果。结果分析 A60 抑菌物质的确定经过抑菌实验后发现全菌液和发酵液（上清液）的抑菌效果最好，无菌水菌悬液（细胞）有一定的抑菌效果，细胞破碎后上清液（细胞破碎液）的抑菌效果较小。该实验可以的抑菌物质存在于上清液中，为胞外次级代谢产物。其中全菌液抑菌效果略好于上清液抑菌效果好于细胞破碎液，推测是活菌在继续分泌抑菌物质的原因。具体结果如图 3.1

挥发性物质,抑菌效果,拮抗菌

中国农业科学院硕士学位论文第三章侧孢短芽孢杆菌 A60 抑菌机制初步探索3.6.2 拮抗菌 A60 挥发性物质抑菌效果的确定拮抗菌 A60 挥发性物质抑菌结果如下图所示：A 为对照平板，B 为处理平板，菌落直径为 8.32cm，B 为 7.23cm，抑菌率为 13.1%。由图中可以看出，虽然从菌落直径角度看抑菌率不高但是处理平板菌丝生长情况明显较对照平板稀疏，说明拮抗菌 A60 的挥发性物质对辣椒疫霉病菌的菌丝生长有一定的抑制作用。

抑菌效果,稀释液,抑制率,拮抗菌

图 3.3 A60 抑菌谱测定Fig3.3 Antimicrobial spectrum of A603.6.4 不同浓度拮抗菌 A60 无菌发酵液抑菌效果的测定不同浓度拮抗菌 A60 无菌发酵液抑菌效果如下图所示，10 倍稀释液抑制率可达 78.7%，20倍稀释液抑制率为 62.8%，40 倍以上稀释液抑制率则不明显，说明 A60 在 20 倍稀释时也能表现出良好的抑菌效果。

【参考文献】