丝氨酸蛋白酶ACYPI4531在豌豆蚜免疫防御反应中的作用研究

发布时间：2020-08-22 18:14

【摘要】：蚜虫是具刺吸式口器的昆虫,数量庞大、繁殖能力强、适应能力强,并具有传播植物病毒的能力,是世界范围内的农业害虫。豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)隶属于蚜总科的蚜科(Aphididea),是第一个被测序的蚜虫,也是首个被测序的不完全变态昆虫。不同于其它昆虫,豌豆蚜基因组缺失了大量的免疫相关基因。尽管如此,豌豆蚜的免疫系统仍能够有效地对抗病原菌的入侵。具有发夹结构域的丝氨酸蛋白酶(serine proteases)在昆虫的胚胎发育、细胞分化、消化代谢、信号转导和免疫防御等过程中起重要作用。本研究利用RNA干扰技术对丝氨酸蛋白酶ACYPI4531基因进行干扰,并分别检测了不同细菌及真菌对豌豆蚜感染后ACYPI4531表达量变化、感染后豌豆蚜的死亡率、体内的细菌数、真菌孢子数和豌豆蚜体内的酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活力。主要结果如下:1对丝氨酸蛋白酶ACYPI4531进行了生物信息学分析,并进行了三维结构的预测,结果显示丝氨酸蛋白酶ACYPI4531具有含发夹结构域的丝氨酸蛋白酶的典型结构特征。2在感染细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)后,豌豆蚜丝氨酸蛋白酶ACYPI4531的表达量在不同的时间点均有不同程度的上调,说明丝氨酸蛋白酶ACYPI4531可能参与豌豆蚜的免疫防御反应。3将ACYPI4531基因干扰之后再感染S.aureus、P.aeruginosa和B.bassiana,豌豆蚜的存活率在感染菌后与对照组相比,略低于对照组但没有明显的差异;其次,蚜虫体内细菌在豌豆蚜体内增殖变快,体内真菌孢子数目也显著高于处理组,进一步说明丝氨酸蛋白酶ACYPI4531参与豌豆蚜的免疫反应。4豌豆蚜体内的PO的活力在ACYPI4531基因干扰后下降,说明ACYPI4531参与血淋巴黑化反应。结论:丝氨酸蛋白酶ACYPI4531一定程度上参与了豌豆蚜对细菌及真菌的免疫防御反应。干扰ACYPI4531能够有效降低豌豆蚜体内PO的活力,说明丝氨酸蛋白酶ACYPI4531参与了豌豆蚜酚氧化酶级联反应。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.3
【图文】：

示意图,豌豆蚜,示意图,抗菌肽

2图 1-1 豌豆蚜免疫通路示意图（Gerardo et al. 2010）Fig. 1-1 Immune pathways of the pea aphid（Gerardo et al. 2010）注：与其它昆虫的主要免疫途径中相关基因相比，在蚜虫中，缺失的 IMD 途径成员（用红线）包括 PGRP 和信号传导的 IMD 等相关基因。Compared with related genes in the main ipathways of other insects, in A. pisum, important signaling IMD, dFADD, Dredd, Rel and othelines) include those involved in pathogen recognition of PGRP are missing.与其它昆虫相比，豌豆蚜体内还缺少了抗菌肽。昆虫体内有多种抗菌肽，在病原微生物的诱导后，与基础水平相较而言，昆虫体内的抗菌肽可成百上千倍的但在豌豆蚜体内却没有抗菌肽的表达，无论是常见的防御素（defensin），还是天（cecropin）（Gerardo et al. 2010）。除此之外，豌豆蚜中还缺少溶菌酶（lysozym这种用于水解细菌细胞壁中特定糖苷键的水解酶，其中主要缺失的是 C 型溶菌酶

序列,冈比亚按蚊,丝氨酸蛋白酶,同系物

构、精蛋白（SEA）结构、Wonton 结构、CUB（C1r/C1s、Uegf、Bmp1）结构、Frizzle 结构和跨膜结构等结构（Cao et al. 2017），以冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）为例，其结构示意图如（图1-2）所示。而 clip 丝氨酸蛋白酶序列中存在三个保守序列（TAAHC、DIAL、GDSGG），一般由 37-55 个氨基酸组成，半胱氨酸富集区中 6 个保守的半胱氨酸形成 3 个二硫键，构成其发夹结构域，并预测绝对保守的 Cys1 和Cys5，Cys2 和 Cys4 以及 Cys3 和 Cys6 分别形成二硫键，由于 Cys 残基之间的区域中具有显著的序列变异性，该结构域可以广义定义为 CX1-14CX3-10CX8-36CX4-18CC（Caoet al. 2015）。Cys1、Cys2 和 Cys5、Cys6 位于形成反向平行 β-折叠的三条 β-链中，并且为 Cys3 和 Cys4 之间的区域提供了独特的序列特征

示意图,丝氨酸蛋白酶,三维结构,大黑鳃金龟

如黑腹果蝇中的 Grass 酶（Kellenberger et al. 2011）、烟草天蛾（Manducasexta）中的 PAP2 酶（Wang et al. 2007）和大黑鳃金龟（Holotrichia diomphalis）中的PPAF2（Piao et al. 2007）（图1-3）。已知结构的发夹结构域中的疏水空腔，可与其它蛋白质结合从而有助于定位或调节 clip 丝氨酸蛋白酶级联的组分（Piao et al. 2014）。

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