家蚕微粒子利用己糖激酶NbHXK和BmHXK调控家蚕细胞代谢和凋亡的研究

发布时间：2020-08-27 09:06

【摘要】：微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,广泛存在于自然界中,能够感染包括人在内的各种脊椎动物和昆虫等无脊椎动物。家蚕微粒子(Nosema bombycis)是第一个被人类认识的微孢子虫,能够感染家蚕并引起家蚕微粒子病(Pébrine),造成重大经济损失,并且严重威胁各国养蚕业的可持续发展。因此,对家蚕微粒子侵染和增殖等过程的分子机制进行深入细致的研究,不仅具有重要的理论价值,也将为家蚕微粒子病等微孢子虫病的防治奠定基础。对专性细胞内寄生的微孢子虫而言,分泌型蛋白的作用极其重要,其中微孢子虫孢壁的形成、对宿主生理代谢的调控以及对宿主细胞免疫系统的抵御等生物学过程都需要依靠分泌型蛋白来完成。因此,针对微孢子虫分泌型蛋白的鉴定,对解析微孢子虫的增殖机制和后续防控研究都具有非常重要的意义。由于微孢子虫无法利用现有技术手段进行基因编辑,近年来,对家蚕微粒子的研究主要集中于其侵染装置功能的解析,而针对微孢子虫在宿主细胞内的增殖过程中起作用的分泌型蛋白研究却鲜见报道。鉴于此,本研究通过微孢子虫数据库(MicrosporidiaDB)和家蚕病原微生物数据库(SilkPathDB)对家蚕微粒子的分泌蛋白进行了全基因组的预测分析,并筛选到了家蚕微粒子己糖激酶NbHXK(Nosema bombycis hexokinase)。NbHXK作为糖酵解途径的代谢酶却具有分泌信号肽序列,我们推测这很可能与家蚕微粒子专性细胞内寄生并高度依赖宿主细胞物质能量供应的增殖方式有关。为了深入探究家蚕微粒子己糖激酶NbHXK的功能,我们进行了如下研究,并得到了以下研究结果:1.家蚕微粒子能够分泌己糖激酶NbHXK家蚕微粒子己糖激酶NbHXK基因全长1287bp,编码一个含有428个氨基酸残基的蛋白。结构域分析发现,NbHXK基因第1~25位氨基酸为预测的信号肽序列,该基因还含有两个保守的己糖激酶结构域(Hexokinase domain),分别位于第29~228位氨基酸和235~424位氨基酸。系统进化分析发现NbHXK归类于微孢子虫属己糖激酶,且与两种蜜蜂微孢子虫的亲缘关系较近。将NbHXK基因的信号肽基因序列克隆到酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,再转化到蔗糖酶缺失型酵母YTK12中,与阳性对照和阴性对照进行比较发现NbHXK的信号肽序列能够诱导目的蛋白蔗糖酶分泌到酵母细胞外,促进转化酵母在YPRAA培养基上的生长。同时克隆的蝗虫微孢子虫己糖激酶AlHXK基因的信号肽序列和线虫微孢子虫己糖激酶NaHXK基因信号肽序列都能达到相同的分泌效果,表明微孢子虫属可能普遍进化出了具有信号肽序列的己糖激酶基因,且与其细胞内寄生的生活方式密切相关。2.家蚕微粒子侵染能够上调宿主BmHXK和BmGLUT的表达在对大造品系的5龄起蚕添食涂布了家蚕微粒子(1×10~6粒/头)的桑叶后,不同时间点取添食家蚕微粒子组和添食清水组的家蚕中肠组织,提取mRNA反转后进行定量研究。在感染家蚕微粒子的家蚕中肠组织中,通过家蚕微粒子的NbSSU基因进行定量发现,家蚕微粒子的拷贝数在感染24h后开始呈现指数级增长;而对家蚕微粒子NbHXK的定量发现在侵染后6-12h和48-72h有两个明显的上调峰,很可能与微孢子虫在宿主细胞内的增殖周期相关。通过对比家蚕微粒子感染前后的家蚕中肠组织发现,家蚕BmHXK和BmGLUT的表达量都受到了显著上调,其中BmHXK的表达量在感染后48h上调了25倍左右,而BmGLUT的表达量在感染后18h上调了8倍左右。在细胞水平对两种家蚕细胞BmN-SWU1和BmE进行研究也发现,家蚕微粒子的侵染能够引起BmHXK的表达量的上调。以上研究结果表明,家蚕微粒子在增殖过程中能够上调宿主细胞BmHXK和BmGLUT的表达量。3.NbHXK和BmHXK都能够促进家蚕微粒子的增殖亚细胞定位鉴定发现,BmHXK核质都有分布,主要定位在细胞质中且在细胞膜周围聚集,NbHXK只定位在宿主细胞质且均匀分布。在家蚕细胞中共转NbHXK和BmHXK后,经PBS饥饿处理6h,发现BmHXK的定位发生了变化,细胞质定位减少,而细胞核定位显著增加,而NbHXK不能响应饥饿处理,始终均匀分布在家蚕细胞质中。通过在家蚕细胞中过表达NbHXK和BmHXK、敲除BmHXK、敲除BmHXK后回复NbHXK,再侵染家蚕微粒子并检测其增殖情况,发现NbHXK和BmHXK都能够促进家蚕微粒子的增殖。通过己糖激酶抑制剂2-DG处理侵染了家蚕微粒子的家蚕细胞,也发现了相同的结果,己糖激酶抑制剂能够抑制家蚕微粒子的增殖。以上研究表明NbHXK和BmHXK具有不同的亚细胞定位特征,且都能促进家蚕微粒子的增殖。4.NbHXK和BmHXK分别与BmVDAC具有相互作用对人类己糖激酶的研究发现,己糖激酶II(Hexokinase-II)能够与电压依赖性阴离子通道蛋白VDAC(voltage-dependant anion channel)相互作用,便于快速获取能量分子ATP进行葡萄糖到葡萄糖-6-磷酸的催化作用。因此,我们克隆了家蚕的电压依赖性阴离子通道蛋白基因BmVDAC(Bombyx mori voltage-dependant anion channel),构建了带有HA标签的基因表达载体,通过免疫共沉淀、双分子荧光互补和荧光共定位实验分别验证BmHXK和NbHXK是否与BmVDAC具有相互作用。结果发现家蚕的己糖激酶BmHXK能够与BmVDAC相互作用,这与其他物种中的研究结果相一致。同时发现家蚕微粒子的己糖激酶NbHXK也能够和宿主的BmVDAC相互作用。与BmVDAC互作,可能是分泌型己糖激酶NbHXK在宿主细胞中行使功能的分子基础。5.NbHXK和BmHXK能够增强宿主细胞代谢并抑制宿主细胞凋亡本研究进一步探索了病原和宿主的两种己糖激酶NbHXK和BmHXK在家蚕细胞代谢与凋亡中的功能。细胞培养液葡萄糖含量测定表明,NbHXK和BmHXK能够促进家蚕细胞对葡萄糖的吸收;细胞内ATP含量检测表明,NbHXK和BmHXK能够增加细胞内的ATP含量;MTS检测细胞增殖实验表明,过表达NbHXK和BmHXK能够促进家蚕细胞增殖;活性氧检测表明,NbHXK和BmHXK都能够降低家蚕细胞内的活性氧水平;过氧化氢诱导凋亡后过流式分析发现,BmHXK能够降低家蚕细胞的凋亡率,而敲除BmHXK显著增加了家蚕细胞凋亡率;同样是过氧化氢诱导凋亡后分别检测Caspase 3/7和Caspase 9的活性,发现NbHXK和BmHXK的过表达能够在一定程度上抑制宿主细胞的凋亡。上述研究内容表明NbHXK和BmHXK一方面能够能增强宿主细胞的物质能量代谢,另一方面可能通过与BmVDAC的相互作用抑制了宿主细胞的凋亡,两种方式共同作用从而有利于家蚕微粒子的增殖。综上所述,本研究发现家蚕微粒子能够通过分泌己糖激酶NbHXK进入宿主细胞质,并且通过上调宿主细胞的己糖激酶BmHXK和葡萄糖转运蛋白BmGLUT的表达量来增强宿主细胞的糖酵解作用以产生更多ATP和中间代谢产物,同时通过两种己糖激酶与BmVDAC的相互作用在一定程度上抑制了家蚕细胞的凋亡,进而保障并促进了家蚕微粒子在家蚕细胞内的增殖过程。本研究揭示了家蚕微粒子调控家蚕细胞物质能量代谢和细胞凋亡的分子机制,不仅为家蚕微粒子病的防控奠定了基础,同时也为人感染微孢子虫病的防治提供了新的思路和靶标。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S884.21
【图文】：

图 1.1 微孢子虫成熟孢子结构图[30]；EN. 孢子内壁；M. 棒状极管；Pl. 片状极膜层；VPl. 囊状极膜；Sp. 孢原质；Nu. 细胞核；Pm. 孢原质膜；PV. 后极泡。agram of a microsporidian spore[30]. EX. Electron-dense exospore; EN.. manubroid; Pl. Lamellar polaroplast; VPl. Vesicular polaroplast; AD. e; Sp. Sporoplasm; Nu. Nucleus; Pm. Plasm membrane; PV. Posterior va虫的侵染机制虫侵染宿主细胞的方式十分独特，被宿主摄入的孢子在外过弹出极管的方式将感染性的孢原质注入到宿主细胞的细管进入宿主细胞的机制存在两种假说，一种假说认为孢子后在强大的作用力下使极管刺穿宿主细胞膜而进入宿主细为，微孢子虫弹出的极丝，在极丝蛋白（特别是 PTP1）与作用下进入宿主细胞[33]（图 1.2）。同时也有研究发现，微噬作用进入细胞，再通过弹出极管的方式逃离宿主形成的

4图 1.2 微孢子虫侵染宿主细胞的不同方式[34]Sporont：母孢子；Meront：裂殖体；Spore：孢子；Sporoblast：孢子母细胞。Figure 1.2 Microsporidia invade host cells by different approach[34].1.1.3 微孢子虫的生活史微孢子虫的生活史大致可以分为 3 个阶段，即感染期（infective phase）、裂殖增殖期（proliferative phase）以及孢子增殖期（sporognic phase），其中感染期是位于宿主细胞外具有侵染能力的阶段，其他两个阶段是位于宿主细胞内的发育阶段[36]（图 1.3）。在感染期，环境中的成熟孢子弹出极管并刺入宿主细胞细胞质，孢原质通过弹出的极管进入宿主细胞质中[33,37,38]。刚由孢子释放出的孢原质（又称

第一章 文献综述体）由未分化的细胞质及来源于极膜层的细胞膜构成，随后在短时间内细胞分化并形成了一层真正的细胞膜，并合成内网膜成为球形细胞，这样便进入殖增殖期或营养生殖期[37]。在裂殖增殖期，芽体在宿主细胞内仍保持圆形和，在吸收宿主细胞的物质和能量后体积逐渐增大，随后芽体以二分裂或多分渐增大发育为裂殖体，然后双核合二为一形成只具有单核的芽体裂殖体，并为母孢子，此过程反复进行，母孢子数量增加，从而进入孢子增殖期[37]。在增殖期，母孢子以二分裂方式形成孢子母细胞，并由孢子母细胞发育成为成孢子，标志着一个生活史的完成[37]。

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2805903