新型抗病毒复配剂筛选及其作用机制研究

发布时间：2020-09-02 12:00

　　本文利用自主研发的抗病毒剂嘧肽霉素(Cytosinpeptidemycin,CytPM)与诱抗剂壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)复配得到了一种兼具预防、治疗和诱抗等多种功能的新型抗病毒剂——嘧肽寡糖(Cytosinpeptidemycin-Chitosan oligosaccharide,CytPM-COS),同时研究了新型复配剂对TMV RNA和蛋白的影响,对寄主活性氧和叶绿素含量的影响,以及诱导寄主产生抗病相关基因的作用,主要研究结果如下:1.通过十种药剂对TMV在系统寄主普通烟K326上的防效和在枯斑寄主心叶烟上的枯斑抑制率调查统计,筛选出了一种效果较好的药剂壳寡糖。壳寡糖对普通烟K326上TMV的防治效果达42.10%,对TMV在心叶烟的枯斑抑制率达56.78%;将筛选出的壳寡糖与嘧肽霉素在本生烟、心叶烟和辣椒上分别筛选最适浓度范围,并在最适浓度范围内复配嘧肽寡糖;再以嘧肽寡糖处理以上三种寄主调查对TMV的防效和枯斑抑制率:对本生烟上TMV的防效为78.78%,对心叶烟上TMV的枯斑抑制率高达91.88%,对辣椒上TMV的防效达到58.24%,新复配的嘧肽寡糖对病毒病的防效均高于单剂嘧肽霉素和壳寡糖。2.利用新复配的嘧肽寡糖从直接作用于病毒和作用于寄主两个方面进行抗病毒机制研究。对病毒作用机制方面,通过Northern blot检测嘧肽寡糖对BY-2单细胞中TMV RNA正、负义链积累量的影响,发现嘧肽寡糖能够有效抑制TMV RNA正、负义链的积累,从而抑制TMV在BY-2中的增殖。通过Western blot检测在BY-2单细胞和本生烟植株两个体系中TMV CP蛋白的积累量,发现经嘧肽寡糖处理过的寄主中TMV CP积累量明显减少;另外,本生烟在接种前后喷施两次嘧肽寡糖对TMV CP的积累量抑制效果最显著。构建TMV CP、TMV MP、TMV p126分别与GFP相连的载体,并将重组质粒导入农杆菌,浸润本生烟,观察嘧肽寡糖处理对TMV的三个蛋白CP、MP、p126在本生烟中定位的影响,发现接种对照中CP聚集在细胞壁上较多,在内质网上较少。经嘧肽寡糖处理,CP聚集在内质网上较多,而结合在细胞壁的量减少,但嘧肽寡糖对TMV MP和TMV p126在细胞中的定位没有明显的影响。嘧肽寡糖可以诱导寄主产生抗病性,是其另一重要作用机制。嘧肽寡糖能够诱导BY-2活性氧含量增加,在处理细胞3 h活性氧含量达到峰值,OD值(600nm)为0.264,是同时间对照OD值的2.06倍;接种TMV清水处理的K326叶绿素含量为0.285 mg/g,嘧肽寡糖处理下叶绿素含量为0.381 mg/g,被TMV侵染的普通烟K326在嘧肽寡糖处理下叶绿素含量增加。通过qPCR定量检测抗病相关基因发现,嘧肽寡糖处理下PR5、NPR1、HSP70、HSC70、MAPKKK、WRKY53、WRKY70七个基因均有所上调,其中HSP70上调了31.60倍,PR5上调了16.15倍,上调极显著;NPR1、WRKY53分别上调了8.51倍、8.06倍,也显著上调;表明嘧肽寡糖能够诱导寄主产生抗病性。综上,嘧肽寡糖能够抑制TMV-RNA、TMV CP的积累,并且对TMV CP的定位产生影响,还能够促使寄主植物活性氧和叶绿素含量增加,诱导寄主抗性相关基因表达量上调。3.嘧肽寡糖田间应用试验表明,嘧肽寡糖对烟草病毒病的防效为40.17%~40.33%,显著高于宁南霉素、嘧肽霉素、壳寡糖;嘧肽寡糖对辣椒病毒病防治效果最好,高达34.03%~37.03%,明显优于嘧肽霉素、壳寡糖;同样,嘧肽寡糖对番茄病毒病的防效也达到34.53%~36.73%,高于嘧肽霉素、壳寡糖。综上,表明嘧肽寡糖对烟草、辣椒和番茄病毒病具有良好的防治效果。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S482.2
【部分图文】：

心叶烟,药剂处理,并接,寡糖

图 1-1 药剂处理并接种 TMV 的心叶烟Fig 2-1. N. glutinosa inoculate TMV with pesticides清水处理接种 TMV，2 为 COS 50 μg/mL 处理并接种 TMV，3 为 COS 100 μg/mL 处理并接种 TMV，4/mL 处理并接种 TMV，5 为 CytPM 50μg/mL 处理并接种 TMV，6 为 CytPM 100 μg/mL 处理并接种 T寡糖处理并接种 TMV，8 为清水接种 PBS 缓冲液。2.2 嘧肽寡糖对系统寄主本生烟侵染 TMV 的作用效果嘧肽寡糖、嘧肽霉素和壳寡糖在接种 TMV 的本生烟上都具有抑制作用，且嘧防效高达 78.78%，显著高于两种单剂不同浓度的防效。表明复配剂嘧肽寡糖霉素、壳寡糖单剂，二者复配后具有增效作用。表 2-5. 药剂对接种 TMV 的本生烟的防效Table 2-5. Control efficiency of pesticides on TMV at Nicotiana benthamiana处理病情指数防效（%）显著性嘧肽寡糖 15.56 78.78 aCOS 50 μg/mL 28.89 60.60 bCOS 100 μg/mL 31.11 57.58 b

药剂处理,肽霉素,寡糖,积累量

图 3-1.药剂处理的 BY-2 原生质体内 TMV RNA 积累量Figure 3-1. Accumulation of TMV RNA in BY-2 protoplast treated with pesticidesV 只接种 TMV 无药剂处理；嘧肽寡糖为接种 TMV 并嘧肽霉素 25 μg/mL 与壳寡糖 12.5 μg/mL 处理；Mock 为不接种 TMV 且无剂处理；其余均为接种 TMV 并药剂处理。嘧肽寡糖对寄主内 TMV 外壳蛋白积累量的影响.1 嘧肽寡糖对 BY-2 原生质体中 TMV CP 积累量的影响BY-2 原生质体接种 TMV 病毒粒子，并用药剂处理 20 h，提取蛋白。经 Western b TMV CP 的结果显示，在无药剂处理情况下 TMV CP 在 20 h 较 4 h 积累量明显表明 TMV 在 BY-2 原生质体中能够正常进行复制增殖。三个药剂对 TMV CP 的有不同程度的抑制作用，且在嘧肽寡糖处理下，TMV CP 积累量显著少于只接的积累量，嘧肽寡糖对 TMV CP 的抑制效果较单剂嘧肽霉素和壳寡糖抑制效果

积累量,原生质体,药剂,肽霉素

图 3-2. BY-2 原生质体内 TMV CP 积累量Figure 3-2. Accumulation of TMV CP in BY-2 protoplast treated with pesticideV 4 h 为接种 TMV 无药剂 W1 培养液中培养 4 h；TMV 20 h 为接种 TMV 无药剂 W1 培养液中培养 20 h；嘧肽霉素为接种肽霉素 25 μg/mL 的 W1 培养液中培养 20 h；壳寡糖为接种 TMV 并在含 12.5 μg/mL 的 W1 培养液中培养 20 h；嘧肽寡糖为接在含嘧肽霉素 25 μg/mL 与壳寡糖 12.5 μg/mL 的 W1 培养液中培养 20 h；Mock 为接种 PEG 并在无药剂 W1 培养液中培养 2.2 嘧肽寡糖对本生烟中 TMV CP 积累量的影响从图 2-3 中可以看出接种 TMV 第 6 天，对照无药剂处理接种 TMV 后出现严重皱缩、脱水、叶脉坏死的症状；处理 1 出现了轻微花叶现象；处理 2 出现花叶并且个别叶脉出现坏死迹象；处理 3 出现花叶和皱缩现象；Mock 无感病症状的，图 3-4 Western blot 检测结果显示药剂处理后 TMV CP 积累量均少于对照 3-3 本生烟的发病情况相符，处理 1 喷施两次药剂对 TMV 的抑制效果最佳，种前喷药和处理 3 接种后喷药对 TMV 具有一定的抑制效果，但抑制作用次于施两次药剂，Mock 中没有检测到 TMV。

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