中华蜜蜂MKK6基因介导的MAPK级联途径在氧化应激中的功能分析
发布时间：2020-09-02 18:42
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是细胞内重要的信号转导途径,能够被细胞因子、激素和各种细胞应激源等刺激物激活,进而调控细胞对外界刺激的响应。MAPK信号通路在生长发育、氧化应激和免疫反应中发挥重要作用。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是中国主要的蜜蜂品种,对维持生态和农业发展的平衡具有重大贡献。然而自然生态环境的恶化使中华蜜蜂的生存与繁殖受到了威胁,因此了解中华蜜蜂在氧化应激中的防御机制对其种群的发展具有重要意义。本研究以中华蜜蜂为实验材料,开展了MKK6基因的功能研究,从分子水平上探讨了AccMKK6介导的MAPK级联途径在抵抗氧化应激反应中的功能。具体研究结果如下:通过PCR的方法从中华蜜蜂中分离获得AccMKK6的开放阅读框,长度为1002bp,编码一个333个氨基酸残基的多肽,预测蛋白分子量约为37.63kDa,理论等电点为7.15。通过氨基酸序列比对以及进化树分析发现,中华蜜蜂AccMKK6的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性,且具有高度保守的磷酸化位点和催化结构域。通过qRT-PCR方法对AccMKK6基因在中华蜜蜂不同组织部位和发育时期的表达特性进行了研究。研究结果发现,AccMKK6基因在胸部的表达量最高,其次是表皮和头部;AccMKK6在中华蜜蜂各个发育阶段中均有表达,蛹期表达量较高。中华蜜蜂AccMKK6基因响应非生物胁迫引起的氧化应激反应。通过qRT-PCR方法探究了AccMKK6在非生物胁迫中的表达特性,结果发现,AccMKK6基因的转录水平受过氧化氢、重金属和农药等非生物胁迫诱导提高。Western blot结果在蛋白水平上进一步证明AccMKK6受非生物胁迫的调控。过表达AccMKK6蛋白的大肠杆菌对非生物胁迫的抗性增强。通过抑菌实验分析重组AccMKK6蛋白的功能,结果发现在H_2O_2和HgCl_2处理后过表达AccMKK6的大肠杆菌的抑菌圈小于对照组。中华蜜蜂AccMKK6基因沉默后抗氧化基因表达量和抗氧化酶活性降低。将dsAccMKK6注射入成年蜜蜂体内,qRT-PCR和Western blot结果显示,蜜蜂体内AccMKK6的表达量显著下降。通过检测AccSOD1,AccSOD2,AccGSTS4,AccCYP4G11,AccGSTO2和AccGSTD基因表达水平发现,这些抗氧化相关基因的转录水平在AccMKK6沉默后降低。检测到AccMKK6沉默后中华蜜蜂体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性降低,但是丙二醛(MDA)含量升高。AccMKK6-Accp38b-Acckayak级联途径参与中华蜜蜂抗氧化应激过程。通过酵母双杂交和GST pull-down实验得到AccMKK6的下游基因Accp38b,并发现Accp38b与Acckayak互作。研究发现Acckayak基因的转录水平受过氧化氢、重金属和农药等非生物胁迫诱导提高。同时,AccMKK6沉默后Accp38b和Acckayak的转录水平升高。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S891
【部分图文】：
图 1-1 在受体-配体相互作用后，不同的细胞外刺激可以激活丝裂原激活蛋白激酶家族。这个家族的成员通过在丝氨酸/苏氨酸氨基酸中加入磷酸基来相互激活。（Hommes et al., 2003）Fig. 1-1 Different extracellular stimuli can activate the family of mitogen activated protein (MAP) kinases afterreceptor-ligand interactions. Members of this family activate each other by adding phosphate groups to serine/threonineamino acids.MKKK 数目众多，目前为止在哺乳动物基因组中发现 14 种 MKKK，拟南芥基因组中发现 80 种 MKKK，水稻基因组中发现 75 种（C et al., 1999；Singh et al., 2012；Hadiartoet al., 2006）。在结构上，MKKK 家族基因存在许多特殊的结构域以便于感知并结合外源信号分子，从而开启多种不同的信号通路。这些结构域包括能够与膜上磷酸肌醇类化合物 PIP2、PIP3、PI3等结合的 PH 结构域（Pleckstrin homolgy domain）、能够识别并结合富含脯氨酸和疏水残基的蛋白质的 SH3 结构域（Src homology domain）、G 蛋白结合位点（Binding sites for G proteins）、锌指结构域（Zinc finger domain）以及亮氨酸拉链结构域（Leucine zipper domain）等（Hirt, 2000）。MKK 能够将信号分子从上游 MKKK 传递到下游 MAPK，被看作是 MAPK 信号通
图 3-1 中华蜜蜂 AccMKK6 基因的分离获得DL2000 DNA Marker；1-3，AccMKK6 的 PCR 反应产Fig. 3-1 Isolation of AccMKK6 open reading frameL2000 DNA Marker; 1-3, PCR reaction products of Acc6编码的氨基酸序列分析站 ExPASY 对分离获得的中华蜜蜂 AccM放阅读框长为 1002bp，编码一个 333 3kDa，理论等电点（pI）为 7.15。件对不同物种的多个 MKK6 氨基酸序与意大利蜜蜂 AmMKK6（XP_00656238.1）、小菜蛾 PxMKK6（XP_011548及伊蚊 AaMKK6（XP_021704117.1）的 93.7%，91%，73.5%，73.1%，70.7%。
中华蜜蜂 MKK6 基因介导的 MAPK 级联途径在氧化应激中的功能分析框标出的 SxxxT 基序。基于中华蜜蜂和意大利蜜蜂、家蚕、果蝇等昆虫的 MKK 氨基序列，采用邻结法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。从图 3-2B 中可以看出昆虫的MKK明显分为MKK1、MKK4、MKK3/6、MKK7四个支。AccMKK6属于MKK3支，与意大利蜜蜂的 AmMKK3 有密切的进化关系。
本文编号：2810957
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S891
【部分图文】：
图 1-1 在受体-配体相互作用后，不同的细胞外刺激可以激活丝裂原激活蛋白激酶家族。这个家族的成员通过在丝氨酸/苏氨酸氨基酸中加入磷酸基来相互激活。（Hommes et al., 2003）Fig. 1-1 Different extracellular stimuli can activate the family of mitogen activated protein (MAP) kinases afterreceptor-ligand interactions. Members of this family activate each other by adding phosphate groups to serine/threonineamino acids.MKKK 数目众多，目前为止在哺乳动物基因组中发现 14 种 MKKK，拟南芥基因组中发现 80 种 MKKK，水稻基因组中发现 75 种（C et al., 1999；Singh et al., 2012；Hadiartoet al., 2006）。在结构上，MKKK 家族基因存在许多特殊的结构域以便于感知并结合外源信号分子，从而开启多种不同的信号通路。这些结构域包括能够与膜上磷酸肌醇类化合物 PIP2、PIP3、PI3等结合的 PH 结构域（Pleckstrin homolgy domain）、能够识别并结合富含脯氨酸和疏水残基的蛋白质的 SH3 结构域（Src homology domain）、G 蛋白结合位点（Binding sites for G proteins）、锌指结构域（Zinc finger domain）以及亮氨酸拉链结构域（Leucine zipper domain）等（Hirt, 2000）。MKK 能够将信号分子从上游 MKKK 传递到下游 MAPK，被看作是 MAPK 信号通
图 3-1 中华蜜蜂 AccMKK6 基因的分离获得DL2000 DNA Marker；1-3，AccMKK6 的 PCR 反应产Fig. 3-1 Isolation of AccMKK6 open reading frameL2000 DNA Marker; 1-3, PCR reaction products of Acc6编码的氨基酸序列分析站 ExPASY 对分离获得的中华蜜蜂 AccM放阅读框长为 1002bp，编码一个 333 3kDa，理论等电点（pI）为 7.15。件对不同物种的多个 MKK6 氨基酸序与意大利蜜蜂 AmMKK6（XP_00656238.1）、小菜蛾 PxMKK6（XP_011548及伊蚊 AaMKK6（XP_021704117.1）的 93.7%，91%，73.5%，73.1%，70.7%。
中华蜜蜂 MKK6 基因介导的 MAPK 级联途径在氧化应激中的功能分析框标出的 SxxxT 基序。基于中华蜜蜂和意大利蜜蜂、家蚕、果蝇等昆虫的 MKK 氨基序列，采用邻结法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。从图 3-2B 中可以看出昆虫的MKK明显分为MKK1、MKK4、MKK3/6、MKK7四个支。AccMKK6属于MKK3支，与意大利蜜蜂的 AmMKK3 有密切的进化关系。
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 张立微;张红玉;;传粉昆虫生态作用研究进展[J];江苏农业科学;2015年07期
2 李捷;朱朝东;王凤鹤;黄敦元;张彦周;丁亮;黄海荣;;野生蜜蜂及其传粉作用的研究现状[J];生物多样性;2007年06期
本文编号：2810957
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