亚洲玉米螟CPR家族表皮蛋白的表达纯化及与几丁质的相互作用

发布时间：2020-09-02 21:07

　　 亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)是我国玉米最重要的害虫,了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分,因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CP26703、CP27370分别是亚洲玉米螟体壁、头壳表皮转录组中相对丰度最高的表皮蛋白基因。序列分析发现CP26703、CP27370分别属于CPR家族中RR-1、RR-2亚家族的表皮蛋白,含有RR结构域,推测可能是通过结合几丁质来发挥功能。为了研究这2种表皮蛋白CP26703、CP27370与几丁质的相互作用,本研究进行了以下工作:(1)通过对亚洲玉米螟头壳和体壁表皮转录组数据的分析,以及与NCBI数据库的对比,得到了表皮蛋白基因CP26703、CP27370的cDNA序列。对2种表皮蛋白的氨基酸序列分析可知,CP26703、CP27370的N端均存在信号肽序列,是分泌性的表皮蛋白;CP26703属于亲水性蛋白,但CP27370中存在一段强疏水性序列;2种蛋白均由β折叠和无规卷曲二级结构交替构成。多重序列比对结果表明,CPR家族表皮蛋白都存在高度保守的RR基序。(2)利用pET-SUMO载体实现了融合蛋白SUMO-CP26703和SUMO-CP27370的可溶表达,并通过SUMO蛋白酶处理及两次金属螯合亲和层析纯化得到了目的蛋白CP26703、CP27370,平均收率分别为5 mg/L、6 mg/L。(3)几丁质结合实验发现,2种表皮蛋白对不同类型几丁质的结合具有选择性。CP26703对α-几丁质和脱乙酰几丁质结合能力很强,对胶体几丁质结合能力较强,但不与β-几丁质结合;CP27370对这4种几丁质结合能力普遍较弱,但与β-几丁质、脱乙酰几丁质的结合能力稍强。(4)脱乙酰几丁质(壳聚糖)结合实验发现,CP26703能与脱乙酰几丁质结合并使其发生团聚,但CP27370不能。圆二色光谱分析表明,CP26703在结合脱乙酰几丁质后,其二级结构中平行β折叠和β转角比例分别上升了18.4%和11.7%,而反平行β折叠及无规卷曲的比例则分别下降了20.4%和11.4%;CP27370中反平行β折叠和β转角的比例分别降低了10.0%和6.3%,而平行β折叠及无规卷曲的比例则分别提高了3.9%和10.5%。表明这2种表皮蛋白可以改变自身构象,从而实现与几丁质更好的结合。同时,蛋白CP26703的加入引起脱乙酰几丁质混合溶液的储存模量(G’)变为原来的2.4倍,且复合黏度增大了87.0%。本研究发现了CPR家族的2种亚家族表皮蛋白RR-1、RR-2与不同类型几丁质的结合存在特异性,而且在结合过程中蛋白的二级结构会发生变化,这加深了对于CPR家族表皮蛋白与几丁质相互作用的认识,有助于进一步了解昆虫表皮的形成机制。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.132

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本文编号：2811101