花生荚壳抗黄曲霉菌侵染种质发掘及抗性关联分析

发布时间：2020-09-18 19:48

　　花生(Arachis hypogaea L.)是世界范围内重要的植物油脂和蛋白质来源,近三十年来中国花生总产量和消费量稳居世界首位,在保障国家食物安全中作用不可替代。然而,黄曲霉毒素污染是影响花生食品安全和产业发展的重要因素,提高花生品种抗性是降低黄曲霉毒素污染风险的迫切需要。花生荚壳是抵御黄曲霉菌侵染的第一道防线,但国内外尚未有效开展花生荚壳对黄曲霉菌侵染抗性的研究,限制了这一抗性的改良与应用。本研究通过对不同花生品种在实验室条件下接种黄曲霉菌,首次建立了花生荚壳对黄曲霉菌侵染抗性的鉴定方法,进而对中国、国际半干旱研究所(ICRISAT)和美国花生微核心种质进行了荚壳抗性的鉴定,发掘出了抗性种质。同时,利用新开发的SSR和SNP分子标记对中国花生微微核心种质进行了荚壳抗性的关联分析,获得了与抗性显著关联的位点。1.通过花生荚果接种对比试验观察,首次将花生荚果(壳)受黄曲霉菌侵染程度划分为1~9级,并确立了荚果感染指数的计算方法。选取代表性花生品种J11、徐花13、中花6号和中花12进行实验室接种黄曲霉菌,比较品种间病情动态变化及差异,经综合分析确立了荚壳抗性鉴定的最合适接种浓度为2×10~6孢子/mL、最合适培养时间为7天。经遗传多样性丰富的花生材料接种验证,该方法可有效区分不同花生品种的抗性差异,为花生荚壳黄曲霉侵染抗性研究提供了技术手段。2.利用所建立的荚壳抗性鉴定方法,对99份中国花生微微核心种质进行了三轮抗性鉴定。根据鉴定结果的比较分析,发现Zh.h1837、Zh.h2339、Zh.h2359、Zh.h4712和Zh.h6180等5份种质材料的荚壳抗性相对较强,而且稳定。以相同方法对ICRISAT和美国花生微核心种质进行接种鉴定,发现8份稳定表现为中抗以上的材料,分别为PI196635、PI494034、PI476432、PI494034、PI337406、PI268586、PI259851和PI296550。本研究是国际上对花生这一特殊性状的首次系统评价,所发掘出的13份稳定抗性种质为花生黄曲霉抗性遗传改良和荚壳抗性机理研究提供了特异材料。3.通过群体结构分析,利用SNP数据将群体分为2个亚群,并通过UPGMA进化树和主成分(PCA)分析得到验证。在此基础上,利用37152个SNP标记与抗性进行关联分析,检测到9个与荚壳抗性显著相关的SNP位点,表型变异解释率为8.60%~31.95%,其中7个位点位于A03染色体上,在染色体片段上分布较为集中,表明该片段对荚壳抗性的表型分化具有显著影响。此外,A04和B02染色体上各检测到1个与抗性显著关联的位点,表型变异解释率分别为23.71%和22.51%。此外,通过554个SSR标记与3个环境下抗性鉴定数据的平均值进行关联分析,共检测到3个与荚壳抗性显著关联的标记位点,其中SSR标记AGGS1483和Ai124P23标记位点表型变异解释率较高,分别为6.54%和6.82%,且都位于A03染色体上。SNP和SSR关联位点的发现对于花生荚壳黄曲霉菌侵染抗性的分子标记辅助育种具有重要应用价值。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.652
【部分图文】：

黄曲霉菌,花生,侵染,级分

发现不同花生材料感染黄曲霉菌的差异较大。有的材料能观察到的荚壳表面感染真菌孢子只产生于荚壳的局部位置；有的材料虽然表面感染较多，但真菌孢子的覆盖；有的材料则不仅荚壳表面均长满黄曲霉菌孢子，而且孢子堆的覆盖度很厚实。这些然条件下花生受黄曲霉菌的感染差异相近，而且也与花生仁人工接种黄曲霉菌后的感。为了区分不同花生品种荚壳受黄曲霉菌感染的相对差异，根据观察到的上述情况并侵染抗性的鉴定方法，将荚壳受感染程度划分为 1-9 级（表 2.1，图 2.1）。其中，表 2面孢子覆盖率是指荚壳表面均匀附着黄曲霉孢子的面积与荚壳表面积之比；荚壳厚孢指荚壳表面斑状、深绿色黄曲霉孢子群所覆盖面积与荚壳表面的比值。表 2.1 花生荚壳受黄曲霉菌感染的 1-9 级Table 2.1 A 1-9 scale of infection by Aspergillus flavus on peanut shells感染等级 1 2 3 4 5 6 7 8 9荚壳表面孢子覆盖率（%）0 0-20 20-40 40-60 60-80 80-100 100 100 10荚壳表面厚孢子覆盖率（%）0 0 0 -5 5-10 10-30 30-50 50-70 70-90 90-1

小写字母,品种间差异,平均数,指数

图 2.3 不同接种方案感染指数均值的品种间差异Fig. 2.3 Varietal differences of mean infection index under different inoculation treatments注：相同小写字母表示 P＜0.05 水平下，两个处理间平均数差异不显著(Tukey)。Note: The same letters indicates no significant difference at 0.05 level by Tukey method．2.3 花生荚壳抗黄曲霉菌侵染鉴定方法的验证利用所建立的花生荚壳侵染抗性鉴定方法，对全球三大代表性花生核心种质共 276 份材料16 年在武汉种植，收获后进行了荚壳抗性的初步鉴定评价。人工接种试验结果发现，不同花质荚壳（荚果）对黄曲霉菌侵染的抗性存在明显差异（图 2.4）。根据 3 次重复接种试验结果均值，276 份花生种质的感染指数分布情况为：感染指数 0.21-0.30 有 2 份，0.31-0.40 有 541-0.50 有 16 份，0.51-0.60 有 52 份，0.61-0.70 有 94 份，0.71-0.80 有 65 份，0.81-0.90 有 29 份91-1.00 有 13 份。从总体上看，276 份花生材料的感染指数呈正态分布（图 2.5），这与花生种黄曲霉侵染或产毒的抗性以及花生对叶斑病、青枯病等抗性的种质间差异分布相似，也符合多基因控制的数量性状的分布特点。这一初步试验结果也表明，利用本研究所建立的接种和方法能区分花生种质资源荚壳抗性的差异，证明该方法具有可行性、有效性和实用性。

黄曲霉菌,侵染,指数分布

图 2.4 不同花生种质荚壳受黄曲霉菌侵染的差异Fig. 3.1 Reaction of different peanut accessions to A.flavus infection in shell图 2.5 276 份花生种质材料的感染指数分布01020304050607080901000.21-0.30 0.31-0.40 0.41-0.50 0.51-0.60 0.61-0.70 0.71-0.80 0.81-0.90 0.91-1.00

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