水稻miRNA对立枯丝核菌侵染的应答反应及纹枯病的早期快速检测
发布时间：2020-09-29 16:51
由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的水稻纹枯病(Rice sheath blight)是水稻三大病害之一,该病害会造成严重的农业损失和经济损失。目前,虽然已经确定了一些功能性基因参与了水稻纹枯病的抗病过程,但没有发现完全抗病的水稻品种或免疫品种,因此对该病的治理方法仍以农药防治为主。尽管水稻纹枯病的危害严重,但对抗性的研究进展缓慢,部分原因是由于缺乏标准的抗性鉴定方法,且该病很容易受到小规模农田的田间条件的影响。基于这种现状,开展水稻抵抗纹枯病菌防御反应的分子机制研究,既可获得更多的抗性种质资源,又为分子育种、提高水稻产量和改善稻米品质提供数据支持和理论基础。1.水稻miRNA对立枯丝核菌侵染的应答反应本研究利用水稻纹枯病病原菌R.solani(YN-7),对感病品种徐稻3号和抗病品种YSBR1两种不同抗性的水稻进行侵染,构建了 3个不同侵染时间点共计12个小RNA文库:水处理Xudao3命名为XC5、XC10和XC20,R.solani处理Xudao3 命名为 XT5、XT10 和 XT20;水处理 YSBR1 命名为 YC5、YC10 和 YC20,R.solani处理YSBR1命名为YT5、YT10和YT20。(1)通过生物信息学对sRNA-seq数据进行分析,结果表明,在测试的水稻品种中存在复杂多样的miRNA群体,从而为发现水稻中植物-病原体相互作用的分子基础提供了有意义的数据库。(2)综合Northern Blot和qRT-PCR分析,进一步验证4种已知的miRNA(miR444b.2、miR531a、miR535-3p 和 miR166i-3p)和 2 种未知的 miRNA(novel_miR1956 和novel_miR135)。(3)通过生物信息学预测这些miRNA的靶基因,并通过烟草共表达实验,证实了 miR535-3p和miR166i-3p分别在转录水平上调控LOC_Os04g16540 和 LOC_Os11g07270 的表达。(4)构建 miRNA 及其靶基因的敲除和过表达载体,进行转基因水稻的表型分析,结果表明,过表达miR535-3p和miR444b.2能提高水稻对纹枯病的抗性,并在株高、穗长及千粒重等方面改变了水稻的农业性状。综上所述,本研究通过RNA-seq的方法,挖掘出一些可能参与水稻抗纹枯病过程的重要miRNA,其具体功能及分子机理将是本研究进一步深入研究的方向,为防治水稻纹枯病提供相关的理论基础。2.水稻纹枯病的早期快速检测(1)基于立枯丝核菌基因组ITS区设计了一对针对病原菌的特异性引物,特异性检测结果准确。(2)使用优化的Quantitative PCR(qPCR)体系建立标准曲线,检测待测样品。标准曲线的决定系数R2为0.9963,完全适用于对该菌的定量检测,且比常规PCR灵敏度高出10000倍,结果稳定可靠。(3)使用R.solani菌株YN-7对五种不同抗性的水稻进行侵染,分别在2hpi,5hpi,8hpi,10hpi和20 hpi的时间点取样并提取水稻基因组DNA。病原菌菌丝棉兰染色组织检查结果与qPCR生物量富集结果一致,表明R.solani侵染水稻10小时后能被准确检测出来,说明本研究建立的快速检测水稻纹枯病发病的方法在农业生产中具备实用性和可推广性。该方法特异性强、灵敏度高、检测迅速,能很好地用于水稻纹枯病菌生物量的定量检测,对掌握病害发生发展及流行以及指导病害预测预报具有重要意义。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.111.42
【部分图文】：
２．１．１逦Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１的接种后表型逡逑抗性品种ＹＳＢＲ１和感病品种Ｘｕｄａｏ３均用兄．ｗ／ａｍ？分离株ＹＮ－７的菌丝体定逡逑殖的火柴梗接种（图２－２Ａ－Ｂ）。在接种后１０ｈｐｉ，显微镜组织棉兰染色观察到逡逑ＹＮ－７的转轮菌丝沿着两个品种的表皮细胞的连接处生长（图２－２邋Ｃ和Ｆ）。发现逡逑两个栽培品种的叶鞘变黄并在２０邋ｈｐｉ时呈现水渍状病斑（图２－２邋Ｄ和Ｇ）。在至逡逑少２０个单独的水稻幼苗上类似地观察到这些结果，这表明在接种后一天（ｄｐｉ）逡逑之前两个栽培种之间的表型相似（图２－２（：－０，？－０）。同时，在２0＾时，丫５８１１１逡逑的病斑长度比Ｘｕｄａｏ３的病斑长度短，并且在２邋ｄｐｉ后随着时间的增加，差异变逡逑得越来越明显。我们的研宄结果表明，ＹＳＢＲ１对兄—的抗性显著强于Ｘｕｄａｏ３逡逑（图邋２－２Ｅ，Ｈ，Ｉ）。逡逑
邋ｓｎＲＮＡ，ｓｎｏＲＮＡ和ｔＲＮＡ。总而言之，这结果显示我们的ｓＲＮＡ文库在逡逑ｍｉＲＮＡ中高度富集。对读数分布，大部分读数来自２号染色体和９号染色体，逡逑并且在这些读数中，超过９０％的读数从感应株转录（图２－４邋Ａ）。所有ｓＲＮＡ的逡逑长度范围从１８至３０ｎｔ。在所有大小类别中，２１和２４ｎｔ的ｓＲＮＡ种类是两个最丰逡逑富的类别（图２－４邋Ｂ）。在ｍｉＲＮＡ序列群中，超过９５％的序列首个碱基为尿嘧逡逑唳（图２－４Ｃ）。研究表明，Ａｒｇｏｎｕａｔｅ蛋白质基于５’末端核苷酸的差异识别不同逡逑ｓＲＮＡ，例如，ＡＧ０１和ＡＧ０５募集具有５’末端尿嘧啶（Ｕ）和胞嘧啶（Ｃ）的逡逑ｓＲＮＡ，而ＡＧ０２和ＡＧ０４分别募集具有５’末端腺苷（Ａ）的ｓＲＮＡ［＿６］。逡逑Ａ逡逑１．８０Ｅ＋０８逡逑■邋Ｓｅｎｓｅ邋■邋Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ逡逑１．６０Ｅ＋０８逦逦邋逦逡逑Ｌ４０Ｅ＋０８逡逑｜逦１．２０Ｅ＋０８逡逑ｕ逡逑Ｓ邋１．００Ｅ＊０８逡逑兰邋３．００Ｅ＊０７逡逑６．００Ｅ＾０７逦■逡逑Ｅｌ邋Ｉｌｉｉｉｌ邋ｌｉｌ．：逡逑＜／■邋ｃ／＂邋＜５？逦＜５？逡逑Ｄ逦Ｃ
因与分子功能中的细胞和细胞成分类别相关，分别在Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１中分配逡逑了近３００和４００个分子功能基因。对于细胞成分类别，结合和催化活性分别与逡逑Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１中的１００和２００个转录物相关（图２－８）。逡逑－邋ＹＳＢＲ１逦门逦逦邋逦逡逑Ｉ？逡逑ｉ邋—逦Ｉ逦ｉ逡逑．．邋Ｉｌｌ邋Ｉ？ｉ邋ｉｌｌ逦Ｉｌｌ邋Ｉ邋ｉ－Ｋ邋！？＜邋Ｉｃ＊邋ｌ邋ＩＩＩ邋Ｇｉｌ邋．．．．邋■．．？邋＿＿逡逑？，邋Ｘｕｄａｏ３逡逑ｉ－逡逑誉一逦＊逡逑ｒO嗗义希恚恚礤危浚欤欤危螅樱翦澹龋濉鲥澹慑澹危眨停礤澹恚梗礤澹螅椋戾危垮濉觥鲥义希浚殄危慑澹慑澹殄危慑危慑危卞澹保保保卞危保卞危卞危″危湾危卞危″危慑危卞危卞危湾危簦″危海翦澹驽危海翦义希翦危欤椋殄危殄危慑危殄澹殄
本文编号：2829996
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.111.42
【部分图文】：
２．１．１逦Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１的接种后表型逡逑抗性品种ＹＳＢＲ１和感病品种Ｘｕｄａｏ３均用兄．ｗ／ａｍ？分离株ＹＮ－７的菌丝体定逡逑殖的火柴梗接种（图２－２Ａ－Ｂ）。在接种后１０ｈｐｉ，显微镜组织棉兰染色观察到逡逑ＹＮ－７的转轮菌丝沿着两个品种的表皮细胞的连接处生长（图２－２邋Ｃ和Ｆ）。发现逡逑两个栽培品种的叶鞘变黄并在２０邋ｈｐｉ时呈现水渍状病斑（图２－２邋Ｄ和Ｇ）。在至逡逑少２０个单独的水稻幼苗上类似地观察到这些结果，这表明在接种后一天（ｄｐｉ）逡逑之前两个栽培种之间的表型相似（图２－２（：－０，？－０）。同时，在２0＾时，丫５８１１１逡逑的病斑长度比Ｘｕｄａｏ３的病斑长度短，并且在２邋ｄｐｉ后随着时间的增加，差异变逡逑得越来越明显。我们的研宄结果表明，ＹＳＢＲ１对兄—的抗性显著强于Ｘｕｄａｏ３逡逑（图邋２－２Ｅ，Ｈ，Ｉ）。逡逑
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本文编号：2829996
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