SVBV-AH侵染性克隆的构建及森林草莓RD21蛋白与SVBVP6蛋白的互作

发布时间：2020-10-18 04:17

　　 草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)属于花椰菜花叶病毒属,本研究克隆了SVBV安徽分离物(SVBV-AH)的全长基因组;利用SVBV-AH全长成功完成侵染性克隆的构建,明确了安徽分离物侵染森林草莓(Fragaria vesca)引起的表型。本课题组已证明SVBV编码的P6蛋白是一个沉默抑制子、反式激活因子和症状决定子,与致病性密切相关。但迄今为止,SVBV P6蛋白与森林草莓蛋白互作的研究尚未见报道。本课题组构建感染SVBV的森林草莓酵母cDNA文库,以P6为诱饵蛋白筛选出与其互作的寄主因子半胱氨酸蛋白酶RD21。利用酵母双杂交实验(Y2H)验证P6蛋白和RD21蛋白在体外互作,且RD21蛋白能抑制P6在植物体内的表达,为进一步揭示SVBV P6蛋白与草莓半胱氨酸蛋白酶RD21互作分子机制为研究寄主植物和病毒之间防御和反防御机理奠定基础。1 SVBV安徽分离物全长基因组的克隆提取于安徽长丰采集到的疑似被SVBV侵染的草莓样本总DNA。PCR以此为模板分段扩增出SVBV-AH片段,拼接后获得pSVBV-AH全长基因组。SVBV-AH基因组序列全长7862 bp,序列登录号为KX787430。比对基因组全序列发现,SVBV-AH与SVBV-BJ及SVBV-SY全基因组序列相似性极高,分别达到97.7%和98.5%,与SVBV-US的序列相似性较高达到85.6%,而与花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)其他成员全长基因组序列相似性较低,仅达到43.4%~44.7%。进一步比对各ORFs核苷酸序列发现SVBV-AH和SVBV-US的ORF II序列差异最大,相似性仅为69.6%,ORF V序列差异最小,相似性为86.5%,说明SVBV在和草莓相互适应过程中不会因为地理隔离发生较大的变异。2 SVBV-AH侵染性克隆的构建及其侵染性鉴定利用SVBV全长基因组克隆pSVBV-AH构建SVBV-AH侵染性克隆pBIN-1.25AHSVBV,转化农杆菌GV3101,接种森林草莓验证侵染性。6周后观察发现,接种SVBV-AH侵染性克隆的森林草莓表现明显的叶脉镶边黄化症状,而接种pBINPLUS的栽培草莓不表现明显症状。Southern blot检测表明,SVBV-AH侵染性克隆可以成功侵染森林草莓。3酵母双杂(Y2H)验证P6与RD21互作pGBK-P6+pGAD-RD21、pGBK-P6+pGAD-RD21分别共转化酵母Y2H;在SD/-Ade/-His和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/不同营养缺陷型培养基培养。结果发现,共转化的酵母菌能够在营养缺陷型培养基上生长,说明P6能够与RD21在体外互作。4森林草莓RD21基因的序列比较及分子进化分析将本研究克隆获得的森林草莓RD21基因与已登录在GenBank的其他植物的RD21基因进行核甘酸序列相似性比较,结果发现,森林草莓半胱氨酸蛋白酶RD21的核苷酸序列与同属蔷薇科的梅花(Prunus mume)、苹果(Malus x domestica)、樱桃(Prunus avium)、梨(Pyrus x bretschneider)和桃(Prunus persica)的核苷酸序列相似性较高,为83.5%-84.8%,与其他植物RD21基因序列的相似性较低,为67.4%-76.5%。构建森林草莓RD21基因和其他植物RD21基因系统发育进化树,结果表明森林草莓RD21基因与同属蔷薇科植物的梅花(P.mume)、苹果(M.domestica)、樱桃(P.avium)、梨(P.bretschneideri)和桃(P.persica)RD21基因单独聚为一个分支,表明森林草莓RD21基因与蔷薇科植物RD21基因的亲缘关系最近。5 Real-time PCR分析森林草莓RD21基因的RNA积累水平SVBV-US侵染性克隆侵染森林草莓35天后,提取发病新叶总RNA,Real-time PCR分析接种空菌株草莓和接毒草莓中RD21基因的表达差异,结果表明,SVBV-US侵染的森林草莓中RD21表达上调。6森林草莓RD21亚细胞定位及与P6蛋白共定位分析含质粒pCM2300-RD21-GFP和pCM2300-P6-RFP的农杆菌共浸润本氏烟,结果表明,RD21蛋白能够定位于本氏烟的细胞质、细胞核边界,共定位实验发现,P6蛋白能够与RD21蛋白共定位于细胞边界。7森林草莓RD21抑制P6在植物体内的表达将含有pGR106-P6-GFP/pGR106和pGR106-P6-GFP/pGR106-RD21表达载体的农杆菌分别注射本氏烟,4天后UV灯下观察荧光发现,pGR106-P6-GFP/pGR106-R D21浸润的叶片中绿色荧光较弱,提取浸润区蛋白进行检测,结果发现检测不到P6蛋白的表达,同时检测P6 mRNA发现,P6 mRNA表达水平一致,说明RD21蛋白能够抑制P6-GFP的表达。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.68
【部分图文】：

图 1-1 SVBV 基因组结构Fig. 1-1 Genomic organization of SVBV毒侵染性克隆于植物中时应具有如下特点：1. 病毒复制组较小易于体外操作；3. 侵染性克隆方便克隆，而其中双生病毒应用范围最广泛，A病毒也是早期被用于制备侵染性克隆的些局限性，如易重组、复制和组装能力有围越来越广泛，这一切都得益于逆转录酶性克隆可用以研究病毒各个基因的功能制和寄主的互作等，从中我们可以获取大的发展，如今植物病毒的侵染性克隆可被[22,23]

pC2-0.5SVBV-AH。（2）以 AH-C1-F 和 AH-C1-R 为引物，以 AHSVBV-II 为模版获得片段，命名AHSVBV-III，与线性化载体 pC1-SVBV-I（Sal I/Kpn I）以重组法相连，得pC1-0.75SVBV-AH。（3）限制性内切酶 Bsp1407 I/Sma I 酶切 pC2-0.5SVBV-AH，得到纯化产物 0.5SVB（Bsp1407 I/Sma I），与线性化载体 pC1-0.75SVBV（Bsp1407 I/Sma I）连接，到 pC1-1.25AHSVBV。（4）限制性 Sal I/Sma I 酶切 pC1-1.25AHSVBV 后，经胶回收后获得 1.25AHSVBV（SI/Sma I）纯化产物，直接与载体 pBINPLUS（Sal I/Sma I）连接，获得质pBIN-1.25AHSVBV。

图 4-2 SVBV-AH 基因组结构特点Fig. 4-2 Structural characteristics of SVBV-AH genome 基因组序列与另外 16 个花椰菜花叶病毒属（列（表 4-2），结果发现 SVBV-AH 全长基因高，分别为 98.5%和 97.7%，与 SVBV-US 的VBV-AH 基因组全长序列与其他 13 个 Cauli3.4%~44.7%（表 4-3）。 ORFs 编码的氨基酸序列与已知的 SVBV 其他BV-AH 和 SVBV-US 的 ORF II 序列差异最大，，相似性为 93.4%。对比 4 个 SVBV 序列也似性高达 93.4%~99.0%，此外 SVBV-AH 和 S酸序列相似性极高，为 95.1%~99.0%，说明 S地理隔离发生较大的变异。 Caulimovirus 其他 13 个成员各 ORFs 氨基酸
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本文编号：2845789