链孢囊菌CGMCC 4.7309次生代谢产物及其抑菌活性研究

发布时间：2020-10-18 12:33

　　 1放线菌是产生多种天然活性物质的重要微生物资源。目前,已发现的微生物源天然产物中,约50%来源于放线菌。但是,随着从链霉菌中发现新型抗生素的几率不断降低,越来越多的研究学者开始对稀有放线菌进行研究。稀有放线菌可以从许多生态环境中分离得到,其中海洋环境由于其具有高盐、高压、低温、低氧、寡营养等特点,使海洋稀有放线菌具有独特的代谢途径并且可以产生结构新颖、活性良好的代谢产物。从上世纪60年代开始,人们就已经将目光转向海洋药物的开发,从海洋稀有放线菌中发现的结构新颖的活性化合物的数量已经远远超过了陆地来源的放线菌。从近些年的研究来看,海洋沉积物来源的稀有放线菌仍是研究中的重点,目前已经报道可以产生活性化合物的海洋来源的稀有放线菌中,约有一半是来自于海洋沉积物。本论文选取的链孢囊菌CGMCC 4.7309是从黄海沉积物中分离得到的一株稀有放线菌,本研究以其为供试材料,采用大孔树脂吸附,凝胶柱层析,薄层层析分离,高效液相色谱制备等多种分离技术,对其次生代谢产物进行分离提纯;通过一维和二维核磁共振波谱、高分辨质谱、红外光谱、紫外光谱等多种波谱技术,对其次生代谢产物的化学结构进行鉴定;通过圆二色谱技术,进一步对其次生代谢产物的绝对构型进行鉴定;利用多种活性检测方法对其次生代谢产物的抑菌活性进行测定。主要获得了以下研究结果:1.结合传统分类学和分子生物学鉴定CGMCC 4.7309菌株为玫瑰链孢囊菌。对CGMCC 4.7309菌株进行形态学和生理生化特征分析,以及16S r DNA序列比对和系统发育树的构建。通过对菌株16S r DNA序列进行PCR扩增、测序、拼接,然后NCBI BLAST基因序列比对,利用Neighbor-Join法构建系统发育树,进行系统发育分析。对该进化树进行分析,结果表明CGMCC 4.7309菌株与玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum DSM 43021)在同一系统进化分枝上,其相似度为100%。再结合此菌株的形态学特征以及生理生化特征均与玫瑰链孢囊菌(S.roseum)相一致,确定CGMCC 4.7309菌株为玫瑰链孢囊菌。2.链孢囊菌CGMCC 4.7309菌株的发酵优化。结合单因素试验以及正交试验的方法,以抑制水稻纹枯病菌的活性作为指标,最终确定最适发酵培养基为:葡萄糖2.0%,土豆淀粉1.5%,玉米浆粉0.4%,酵母提取物0.2%,Na Cl 0.1%,Ca CO3 0.3%。最适发酵条件为:发酵时间9 d,初始p H值7.0,发酵温度28°C,接种量7.5%,转速220 r/min,种子液种龄3 d。3.从链孢囊菌CGMCC 4.7309发酵粗提物浸膏中分离纯化得到7个单体化合物。通过对链孢囊菌CGMCC 4.7309进行大孔树脂吸附、甲醇浸提、二氯甲烷萃取以及凝胶柱层析纯化,得到酒红色发酵粗提物浸膏4.3 g,并且测定发酵粗提物浸膏对9株植物病原真菌和4株细菌的抑菌活性。经过薄层层析分离,得到4个不同极性组分:A-D。采用活性追踪法,根据发酵粗提物浸膏抑菌活性结果,测定A-D四个组分对9株植物病原真菌的抑菌活性。结果表明A-D四个组分均具有不同程度的抑菌活性,故对A-D四个组分进行进一步的分离纯化。利用高效液相色谱和凝胶柱层析等分离方法,最终得到7个单体化合物。4.经结构鉴定,确定7个单体化合物均为芳香聚酮类化合物。通过核磁共振图谱、高分辨质谱、紫外、红外、旋光度测定等检测技术,对所分离纯化得到的7个单体化合物进行化学结构鉴定,并且通过圆二色谱技术确定了单体化合物的绝对构型。通过比较相关文献数据和谱图检测数据,结果表明7个单体化合物均属于芳香聚酮类化合物,其中5个单体化合物为新化合物:Hexaricins D–H(化合物1-5);2个单体化合物为已知化合物:Hexaricin A(化合物6)和Hexaricin C(化合物7)。采用微量稀释法,测试这7个单体化合物对9株植物病原真菌的抑菌活性。结果表明,化合物1、2对几种植物病原真菌均表现出了较好的抑菌活性,其中化合物1对水稻纹枯病菌、水稻稻瘟病菌和番茄灰霉病菌表现出了良好的抑菌活性,EC50分别为4.51±0.28μg/m L、8.85±0.55μg/m L、6.02±0.81μg/m L。5.Hexaricin D对水稻纹枯病菌具有抑制作用且对水稻植株安全。通过测定Hexaricin D对水稻纹枯病菌菌丝生长、生物量以及菌核萌发的影响,表明当Hexaricin D浓度高于4.6μg/m L时,对水稻纹枯病菌菌丝的生长有较强的抑制作用;当浓度大于300μg/m L时,Hexaricin D对水稻纹枯病菌菌核萌发的抑制率均在70%以上,表明Hexaricin D对水稻纹枯病菌的生长发育具有较强的抑制作用。通过对Hexaricin D进行不同温度的处理试验,表明当环境温度低于60°C时,虽然Hexaricin D对水稻纹枯病菌的抑制率有所下降,但还保持一定的抑菌活性,而且当环境温度在40°C左右时,其抑菌活性基本不受影响。在活体盆栽试验中,Hexaricin D对水稻纹枯病表现出了较好的抑制作用,而且对水稻植株表现出了很高的安全性。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S476
【部分图文】：

图 1-1 小单孢菌属代谢产物的分子结构-1 The molecular structure of metabolites produced by Micromon线菌属的代谢产物菌常见于亚热带、热带地区，可以从中分离得到具有谢产物（甄永苏，2004）。抗生素 IB-00208，具有体胞的活性（Maletcascón et al，2003）。含有水杨酸基在适当条件下，水杨酸基团可以与一些含氨基或羟基酰胺或酯。由 Actinomadura madurae IFM 0745 Madurastrtin B1，可以抑制抗藤黄微球菌（Harada

杜拉放线菌属、小双孢菌属、游动放线菌属、糖多孢菌属代谢产物的molecular structure of metabolites produced by Actinomadura, MicrobisporaSaccharopolyspora枝菌酸菌属的代谢产物素和利福平，是该属产生的最具代表性的抗生素，由于其具有用于临床治疗。Kunimoto 等人（2004）从 ML630-mF1 菌株中革兰氏阳性细菌活性的抗生素：Kigamicins A-E。Kigamicins A好的抑制肿瘤细胞。Banskota 等人（2006）利用基因分is orientalis ATCC 43491 菌株中发现了抗生素 ECO-0501，具的作用。Murakami 等（2007）从拟无枝菌酸菌属 SANK 6020菌转移酶Ⅰ抑制剂：A-102395，其 IC50为 11 nmol/L。Dasari 中分离得到一株可以产生新型吡啶盐化合物的菌株：Amyc脑癌 U87MG 细胞、乳腺癌 MCF-7 细胞和宫颈癌 HeLa 细胞并且对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌也有一定的抑制作用

-3 诺卡氏菌属、拟无枝菌酸菌属、糖丝菌属、盐孢菌属代谢产物的分子 molecular structure of metabolites produced by Nocardia, Amycolatopsis, SSalinispora放线菌研究意义和展望作为重要的微生物资源，广泛存在于不同的自然生态环境中，功能各异，与人类的生产和生活极为密切，所具有的应用价值放线菌的代谢类型非常多样化，可以产生多种有用的活性物质草剂、维生素、酶及酶的抑制剂、氨基酸、抗生素等。自从其他学者发现链霉菌并筛选出链霉素后（Gordon and Horan，1生物学家便开始对放线菌进行广泛的研究，放线菌资源的药物的成就。至今为止，已发现的上万种天然抗生素中，有近 2/3 是，如聚酮类、氧杂蒽酮类、生物碱、氨基糖苷类、氯霉素类、大环内酯类和四环素类等活性物质，这其中的许多活性物质都
【参考文献】

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本文编号：2846306