水稻镉胁迫的代谢物差异研究
发布时间：2020-10-31 17:46
水稻是对Cd吸收最强的大宗谷类作物,Cd通过根部-木质部-韧皮部-籽粒的运输途径进入稻米中,经食物链进入人体,对人体健康造成一定的危害。因此,了解低Cd水稻品种的分子机制,有利于解决我国稻米品质安全的问题。基于上述问题,本研究建立了基于亲水作用色谱和反相色谱四极杆-飞行时间质谱技术的水稻代谢物的分析方法,通过水培实验对低Cd水稻突变体和野生型的生态指标进行了测定,筛选出二者的表型差异的Cd浓度及处理时间,同时利用代谢组学技术鉴定出差异特征代谢物,并对差异代谢产物参与的代谢途径进行阐述总结,期望为进一步揭示水稻品种的低Cd积累机制的相关研究提供理论依据,主要研究结果如下:(1)采用Q-TOF/MS分析技术,比较不同提取方法对水稻代谢物提取结果的影响,建立了RPLC和HILIC相结合的水稻代谢物分析方法。以检出峰数目、初步鉴定的代谢物数量、种类以及代谢途径为指标,探讨了甲醇-三氯甲烷-水,甲醇-三氯甲烷-氨水,甲醇-MTBE-水3种提取方法和不同色谱系统对水稻代谢物提取及分离的效果。结果表明,甲醇-三氯甲烷-水对水稻代谢物的检出覆盖率最高,提取到的独有代谢物最多,分别为苯甲酸、木樨草素、α-亚麻酸、乌头酸、赤霉素A12醛、异牧荆素、L-谷氨酸;HSS T3和XBridge Amide色谱柱同时应用实现了对极性不同的代谢物较全面的检测,初步鉴定到16种有机酸、17种核苷酸、21种氨基酸、66种脂肪酸、11种磷脂、7种鞘脂,XBridge Amide在分离检测磷脂和鞘脂类化合物方面具有明显优势;鉴定到的代谢物所涉及的代谢途径为嘌呤代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环、精氨酸代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢、鞘脂代谢、苯丙氨酸代谢以及维生素B2的合成。两种色谱柱初步鉴定到的代谢物和涉及的代谢途径均存在一定的互补性,该方法能够应用于水稻代谢表型的差异性研究。(2)采用低Cd水稻突变体和野生型为实验材料进行水培实验,设置了0、0.1、5μmol/L的Cd浓度梯度处理,并对其进行2 h、1 d、3 d、7 d、15 d的动态取样,研究了不同Cd浓度、取样时间对水稻生长的影响。低Cd水稻突变体和野生型根长、株高、根部干重和地上部干重均随取样时间的延长而增加;当添加Cd浓度(0.1μmol/L和5μmol/L)时,低Cd水稻突变体的生长均没有受到抑制作用,而对应的野生型的生长随Cd的增加受到不同程度的抑制,0.1μmol/L时,野生型与其CK相比没有受到明显抑制,5μmol/L时,野生型的生长受到较明显的抑制;0.1μmol/L处理下,低Cd水稻突变体和野生型的根长、株高、根部干重和地上部干重在不同的取样时间内均无显著差异,5μmol/L处理15 d后二者表现出显著差异;添加Cd浓度(0.1μmol/L和5μmol/L)时,低Cd水稻突变体根部和地上部的Cd含量在不同取样时间内均显著低于野生型,其体内可能存在某些化合物能够抵抗Cd胁迫。(3)利用基于亲水作用色谱和反相色谱四极杆-飞行时间质谱技术的水稻代谢物分析方法对5μmol/L的Cd浓度处理15d的低Cd水稻突变体和野生型所产生的表型差异进行差异代谢物研究。结果表明,低Cd水稻突变体和野生型在根部中共有25个差异代谢物,氨基酸类如丙氨酸、氨基丁酸、缬氨酸、天冬氨酸、脯氨酸,脂类如油酸、植物鞘氨醇、癸酸、PG(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)、PA(19:3(10Z,13Z,16Z)/0:0)、PA(18:2(9Z,12Z)/0:0)这些化合物发生显著变化,对植物抵抗重金属Cd作用较大;地上部中共有22个差异代谢物,有机酸类苹果酸、柠檬酸、延胡索酸,维生素B类如核黄素(维生素B2)、吡哆醛(维生素B6)和泛酸,氨基酸类如羟脯氨酸变化显著,其他氨基酸对水稻的耐Cd性机理需要进行深一步的研究与探索。结合低Cd水稻突变体和野生型的差异代谢物可能参与的代谢途径,主要是氨基酸代谢、有机酸代谢、维生素B类的合成、脂类代谢及三羧酸循环,这些代谢途径的变化可能与低Cd水稻突变体的较强耐Cd性有较大的联系。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S511;X503.231
【部分图文】：
图 2.1 QC 样品穿插于分析序列前、中、后的正离子模式 HILIC（a）和 RPLC（b）色谱叠加图Figure 2.1 Overlaid hydrophilic interaction chromatography (HILIC) (a) and reversed phase liquid chromatography(RPLC) (b) maps of QC samples analyzed in positive mode at the beginning, middle, and end during the analysis worklist2.2.2 代谢物提取方法的选择对比了不同提取溶剂对水稻中极性和非（弱）极性检出峰的数量，结果见表 2.5。在混合质量控制组样品中，XBridgeAmide 色谱柱分离检测到极性和非（弱）极性的检出峰数量分别为 4296和 3589 个，HSS T3 色谱柱为 3936 和 3166 个。由表 2.5 可知，甲醇-三氯甲烷-水、甲醇-三氯甲烷-氨水、甲醇-MTBE-水 3 种方法提取的代谢物经 XBridgeAmide 和 HSS T3 分离检测，其检出峰覆盖度均达 98%以上，无明显差异。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 基于HILIC和RPLC Q-TOF/MS技术的水稻代谢物分析Q-TOF/MS 是四极杆-飞行时间串联质谱技术，该技术不仅可以提供较精确的相对分子质量，还能够提供相关物质的二级质谱。本研究利用 Q-TOF LC/MS 技术进行水稻的代谢物分析，通过化学工作站软件并借助 Metlin、Lipidmaps 数据库进行代谢物鉴定，结果见表 2.5，并对其进行二级质谱扫描，现以 3-脱氢莽草酸为例，提供该化合物的一级、二级质谱图（图 2.2），与 Metlin数据库中的标准二级谱图进行比对，其母离子和二级离子的质量数吻合，说明本研究鉴定的代谢物的可靠性良好。在混合质量控制组样品中，XBridge Amide 色谱柱分离检测到极性代谢物和非（弱）极性代谢物分别为 166 和 90 个，HSS T3 色谱柱为 111 和 108 个。由表 2.5 可知，3 种方法提取的代谢物覆盖率均达 95%以上，而甲醇-三氯甲烷-水提取的代谢物全部覆盖混合质量控制组鉴定到的代谢物且独有代谢物最多，分别是苯甲酸、木樨草素、α-亚麻酸、乌头酸、赤霉素 A12醛、异牧荆素、L-谷氨酸，与甲醇-三氯甲烷-氨水和甲醇-MTBE-水相比，占有一定优势。
图 2.3 XBridgeAmide 和 HSS T3 色谱柱检测到的极性（a）和非（弱）极性（b）代谢物的互补性Figure2.3 Complementary analysis of detected polar (a) and non-(weak) polar (b) metabolites by XBridge Amide HSS T32.2.3.1 水稻中代谢物种类结果分析代谢组学的检测对象主要是生物样品中小分子量的代谢物，如氨基酸、核苷酸、有机酸类等极性和非（弱）极性化合物（尹恒等, 2005）。目前，应用于代谢物分离的液相色谱模式有 RPLC 和 HILIC，其中，反相色谱柱对非（弱）极性化合物的保留及分离有重要作用，反子对色谱可实现离子化合物的分离，但是因离子对试剂污染质谱而限制了其应用（Fan e2014）。HILIC 是近年色谱领域研究的热点之一（王媛等, 2008），它因具有亲水性配基而更极性化合物的分离。据文献报道，脂类在 HILIC 色谱柱上具有较好的保留能力，尤其是磷脂（et al., 2014）。因此，HILIC 能够同时实现极性和脂类代谢物的分离。本实验采用 XBridge A和 HSS T3 色谱柱对水稻中的代谢物进行分离检测，研究了两种色谱柱在鉴定代谢物数量和上的互补性（图 2.4）。由图 2.4 可知，水稻中的代谢物主要分为 6 类：有机酸、核苷酸、氨基酸、脂肪酸、磷鞘脂。XBridgeAmide 和 HSS T3 色谱柱共同分离检测到 6 种有机酸、11 种核苷酸、14 种氨基
【参考文献】
本文编号：2864289
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S511;X503.231
【部分图文】：
图 2.1 QC 样品穿插于分析序列前、中、后的正离子模式 HILIC（a）和 RPLC（b）色谱叠加图Figure 2.1 Overlaid hydrophilic interaction chromatography (HILIC) (a) and reversed phase liquid chromatography(RPLC) (b) maps of QC samples analyzed in positive mode at the beginning, middle, and end during the analysis worklist2.2.2 代谢物提取方法的选择对比了不同提取溶剂对水稻中极性和非（弱）极性检出峰的数量，结果见表 2.5。在混合质量控制组样品中，XBridgeAmide 色谱柱分离检测到极性和非（弱）极性的检出峰数量分别为 4296和 3589 个，HSS T3 色谱柱为 3936 和 3166 个。由表 2.5 可知，甲醇-三氯甲烷-水、甲醇-三氯甲烷-氨水、甲醇-MTBE-水 3 种方法提取的代谢物经 XBridgeAmide 和 HSS T3 分离检测，其检出峰覆盖度均达 98%以上，无明显差异。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 基于HILIC和RPLC Q-TOF/MS技术的水稻代谢物分析Q-TOF/MS 是四极杆-飞行时间串联质谱技术，该技术不仅可以提供较精确的相对分子质量，还能够提供相关物质的二级质谱。本研究利用 Q-TOF LC/MS 技术进行水稻的代谢物分析，通过化学工作站软件并借助 Metlin、Lipidmaps 数据库进行代谢物鉴定，结果见表 2.5，并对其进行二级质谱扫描，现以 3-脱氢莽草酸为例，提供该化合物的一级、二级质谱图（图 2.2），与 Metlin数据库中的标准二级谱图进行比对，其母离子和二级离子的质量数吻合，说明本研究鉴定的代谢物的可靠性良好。在混合质量控制组样品中，XBridge Amide 色谱柱分离检测到极性代谢物和非（弱）极性代谢物分别为 166 和 90 个，HSS T3 色谱柱为 111 和 108 个。由表 2.5 可知，3 种方法提取的代谢物覆盖率均达 95%以上，而甲醇-三氯甲烷-水提取的代谢物全部覆盖混合质量控制组鉴定到的代谢物且独有代谢物最多，分别是苯甲酸、木樨草素、α-亚麻酸、乌头酸、赤霉素 A12醛、异牧荆素、L-谷氨酸，与甲醇-三氯甲烷-氨水和甲醇-MTBE-水相比，占有一定优势。
图 2.3 XBridgeAmide 和 HSS T3 色谱柱检测到的极性（a）和非（弱）极性（b）代谢物的互补性Figure2.3 Complementary analysis of detected polar (a) and non-(weak) polar (b) metabolites by XBridge Amide HSS T32.2.3.1 水稻中代谢物种类结果分析代谢组学的检测对象主要是生物样品中小分子量的代谢物，如氨基酸、核苷酸、有机酸类等极性和非（弱）极性化合物（尹恒等, 2005）。目前，应用于代谢物分离的液相色谱模式有 RPLC 和 HILIC，其中，反相色谱柱对非（弱）极性化合物的保留及分离有重要作用，反子对色谱可实现离子化合物的分离，但是因离子对试剂污染质谱而限制了其应用（Fan e2014）。HILIC 是近年色谱领域研究的热点之一（王媛等, 2008），它因具有亲水性配基而更极性化合物的分离。据文献报道，脂类在 HILIC 色谱柱上具有较好的保留能力，尤其是磷脂（et al., 2014）。因此，HILIC 能够同时实现极性和脂类代谢物的分离。本实验采用 XBridge A和 HSS T3 色谱柱对水稻中的代谢物进行分离检测，研究了两种色谱柱在鉴定代谢物数量和上的互补性（图 2.4）。由图 2.4 可知，水稻中的代谢物主要分为 6 类：有机酸、核苷酸、氨基酸、脂肪酸、磷鞘脂。XBridgeAmide 和 HSS T3 色谱柱共同分离检测到 6 种有机酸、11 种核苷酸、14 种氨基
【参考文献】
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6 邓湘雄;王慧中;徐祥彬;薛大伟;;水稻镉耐性研究进展[J];杭州师范大学学报(自然科学版);2009年06期
7 鄂志国;王磊;;水稻抗病性基因的克隆和功能研究进展[J];遗传;2009年10期
8 王媛;顾惠新;路鑫;许国旺;;以亲水作用色谱为核心的液相色谱联用技术及其应用研究[J];色谱;2008年06期
9 刘欢;韩涛;;代谢组学及其在肝脏疾病研究中的应用进展[J];实用肝脏病杂志;2008年01期
10 唐惠儒;王玉兰;;代谢组研究[J];生命科学;2007年03期
本文编号：2864289
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